滌痰湯通過PKA/CREB通路對阿爾茨海默病模型大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化及行為學(xué)的影響研究*

王 玥，楊 暢，金春峰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)解剖組胚教研室，遼寧 沈陽 110847)

阿爾茨海默病(AD)屬呆病范疇，由20世紀(jì)德國醫(yī)生阿洛伊斯·阿爾茨海默發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙、認(rèn)知功能障礙、語言障礙等。最新中醫(yī)學(xué)研究顯示，AD以腎虛尤甚的五臟虛衰為內(nèi)在機(jī)制，痰濁為加速本病發(fā)展的重要因素，且五臟虛衰和痰濁兩者互為因果、相互影響，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。目前，AD尚無有效的藥物根治方法，會給社會及患者家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，如何預(yù)防AD發(fā)病及延緩AD病程已成為神經(jīng)病理學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向之一。

AD的主要病理學(xué)特征為：(1)大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核和丘腦中大量β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的老年斑(SP)；(2)大腦皮質(zhì)和海馬變性神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)由過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)。正常情況下，tau蛋白能夠與神經(jīng)元微管結(jié)合并促進(jìn)微管的組裝和穩(wěn)定，并通過與多種蛋白相互作用來行使神經(jīng)元的正常軸漿運(yùn)輸、維持突觸可塑性和神經(jīng)元存活等功能。然而，tau蛋白過度磷酸化后生物學(xué)活性降低，生理功能喪失，最終導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)NFTs，細(xì)胞隨之變性死亡，學(xué)習(xí)記憶功能受損。因此，tau蛋白過度磷酸化與AD發(fā)病關(guān)系密切，目前研究熱點(diǎn)主要集中在抑制tau過度磷酸化和修復(fù)受損的神經(jīng)元方面，但缺乏有效的中醫(yī)中藥治療措施。

滌痰湯出自明代王肯堂的《證治準(zhǔn)繩》，由茯苓、半夏、膽星、竹茹、枳實(shí)、人參、石菖蒲、甘草加生姜等組成，具有化濁開竅、益氣祛痰等重要作用。相關(guān)研究顯示，滌痰湯可逆轉(zhuǎn)AD模型大鼠的空間記憶能力[1-2]，還可以改善老年認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。其機(jī)制可能是通過下調(diào)海馬γ-分泌酶的水平，進(jìn)而降低海馬SP水平[3]。滌痰湯可有效地抑制SP的沉積并改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力，但滌痰湯能否抑制tau蛋白磷酸化及改善AD認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)障礙尚有待探討。

1 材料與方法

1.1一般材料 選取250～300 g雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。設(shè)定白天、黑夜各為12 h，溫度(25±1)℃，濕度45%～55%，自由進(jìn)食水。將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、滌痰湯組、西藥組，每組10只。對照組、模型組的大鼠常規(guī)麻醉后，利用腦立體定向儀固定大鼠頭部，選擇大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)(前鹵后3.3 mm、中線外側(cè)1.5 mm、硬腦膜下3.0 mm)，用微量進(jìn)樣器顯微注射4 μL Aβ1-40(10 mg/mL)，勻速緩慢注射5 min，注射完畢后再留針5 min，縫合傷口。滌痰湯組大鼠常規(guī)麻醉后，利用腦立體定向儀固定大鼠頭部，選擇大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)(前鹵后3.3 mm、中線外側(cè)1.5 mm、硬腦膜下3.0 mm)，用微量進(jìn)樣器顯微注射4 μL老化Aβ1-40(10 mg/mL)，勻速緩慢注射5 min，注射完畢后再留針5 min，縫合傷口。造模4 d后，滌痰湯組大鼠每天灌胃80 mg/kg滌痰湯，灌胃體積為2 mL，西藥組大鼠給予哈伯因混懸液，其余組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。10 d后過量麻醉處死各組大鼠，取腦組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2方法

1.2.1藥品制備 滌痰湯方中各藥量分別為半夏7.5 g、茯苓6 g、膽星7.5 g、枳實(shí)6 g、竹茹2 g、人參3 g、石菖蒲3 g、甘草1.5 g、生姜2.5 g，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。該方先煎40 min，再煎30 min，藥液混合過濾濃縮至1 g/mL，放于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｆ渌幤吩噭┌ǎ汗?河南太龍藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10940156)、全蛋白提取試劑盒(wanleibio)、BCA蛋白測定試劑盒(wanleibio)、ECL發(fā)光液(wanleibio)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、p-蛋白激酶A(p-PKA)、蛋白激酶A(PKA)、p-環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)、環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、tau(wanleibio)、p-tau(Affinity)、羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-HRP(wanleibio)、內(nèi)參抗體β-actin(wanleibio)、NeuN(abcam)、p-tau S202(GeneTex)、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Beyotime)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(Beyotime)、山羊血清(Solarbio)、DAPI(Beyotime)、抗熒光淬滅劑(Solarbio)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器 超純水系統(tǒng)(Heal Force，型號：NW10LVF)，-70 ℃超低溫冰箱(中科美菱，型號：DW HL-668)，超凈工作臺(蘇州凈化，型號：VD-850)，水平搖床(北京六一公司，型號：WD-9405B)，微量移液器(BIOHIT，型號：Proline)，電泳儀(北京六一公司，型號：DYY-7C)，轉(zhuǎn)移槽(北京六一公司，型號：DYCZ-40D)，酶標(biāo)儀(BIOTEK，型號：ELX-800)，顯微鏡型號(OLUMPUS，型號：BX53)，顯微鏡拍照系統(tǒng)(OLUMPUS，型號：DP73)。

1.2.3水迷宮 實(shí)驗(yàn)前，將水池水溫加熱至25 ℃左右，倒入牛奶，將池底背景染成白色，并在水池四周墻壁上標(biāo)記不同形狀的圖形。Morris水迷宮設(shè)有4個象限，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，實(shí)驗(yàn)水池上方通過攝像鏡頭的影像跟蹤系統(tǒng)與計(jì)算機(jī)相連，采用ZH0065 Plus Image Analyzer記錄實(shí)驗(yàn)過程。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時保持室內(nèi)環(huán)境的安靜。首先，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，平臺設(shè)在第三象限，露出水面約1.5 cm，各組大鼠均在第Ⅰ象限指定位置邊緣入水，記錄大鼠60 s內(nèi)尋找到平臺的時間。若大鼠未尋找到平臺，則引導(dǎo)至平臺，停留10 s。次日，將實(shí)驗(yàn)大鼠從第一象限貼壁放入水中，通過影像跟蹤系統(tǒng)記錄各組大鼠60 s內(nèi)找到平臺的時間(即逃避潛伏期)及所經(jīng)過的路程，每只大鼠試驗(yàn)3次，時間間隔約30 min。在實(shí)驗(yàn)過程中，倘若有大鼠未找到平臺，則時間記錄為60 s。實(shí)驗(yàn)第3～4天進(jìn)行隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)。在隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)中，平臺位置及大鼠入水位置不變，水面超過平臺1.5 cm，大鼠從入水到找到平臺的時間即為逃避潛伏期。在水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第5天，撤去平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄并分析大鼠的游泳軌跡、穿越平臺的次數(shù)及各象限的停留時間等，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以此作為評價大鼠空間認(rèn)知和記憶能力的指標(biāo)。

1.2.4Western blotting檢測 (1)蛋白質(zhì)抽提與定量后，選用與目的蛋白相對分子質(zhì)量相對應(yīng)的聚丙烯酰胺凝膠，先配制分離膠，將混勻的液體沿玻璃板一側(cè)灌入，上層用水封好以促進(jìn)凝膠聚合；然后配制濃縮膠，水層倒掉后將濃縮膠緩慢灌入，最后用梳子封口，待膠完全凝固后即可拔出梳子。安裝電泳槽，分別向電泳槽的正極和負(fù)極注入電泳液，每孔加入20 μL電泳蛋白上樣液，最后加入5 μL蛋白Marker，連通電極，通常電泳條件為電壓90 V，恒壓電泳約為2 h。轉(zhuǎn)膜的條件為電壓90 V，冰水中轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出PVDF，浸入TBST中，放于左右搖床搖動5 min，搖床3次。將PVDF浸入5%脫脂奶粉溶液中，搖床緩慢搖動封閉1 h。一抗4 ℃過夜。次日，將PVDF浸入TBST中，搖床搖動5 min，搖床3次。二抗孵育2 h。ECL底物發(fā)光，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的吸光度。

1.2.5免疫熒光染色和共聚焦激光掃描顯微術(shù) 將切片架分別浸于Ⅰ級和Ⅱ級二甲苯中脫蠟各15 min。取出切片，依次浸入95%、85%、75%乙醇各1 min。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5 min，沖洗3次。置于煮沸抗原修復(fù)液中，低火修復(fù)10 min。PBS沖洗5 min，沖洗3次。使用濾紙片將每張切片擦干，免疫組化筆在組織周圍畫圈，防止滴加液體時外溢。滴加山羊血清于濕盒內(nèi)室溫15 min。取出切片，擺放在切片架上，PBS沖洗5 min，沖洗3次。一抗4 ℃過夜。PBS沖洗5 min，沖洗3次。以下操作注意避光，滴加熒光二抗(1∶200稀釋的PBS)室溫孵育60 min。PBS沖洗5 min，沖洗3次。滴加DAPI至完全覆蓋組織以復(fù)染核。抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察染色效果，400倍鏡下拍照(標(biāo)尺長度50 μm)。

2 結(jié) 果

2.1滌痰湯對AD模型大鼠行為學(xué)的影響 學(xué)習(xí)記憶能力障礙是AD重要的癥狀之一。在對AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力的評估中，水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法已成為檢測實(shí)驗(yàn)動物學(xué)習(xí)記憶能力及空間探索能力的重要手段，也是判斷癡呆的基本方法。結(jié)果顯示，滌痰湯組、西藥組大鼠前兩天、后兩天的平均逃避潛伏期和搜索平臺的平均路程均顯著低于模型組大鼠，但卻略高于對照組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠運(yùn)動軌跡多沿池壁或遠(yuǎn)離相應(yīng)平臺位置，而滌痰湯組和西藥組大鼠的運(yùn)動主要集中在相應(yīng)平臺位置，且其經(jīng)過相應(yīng)平臺位置的次數(shù)明顯高于模型組大鼠，表明滌痰湯灌胃干預(yù)后大鼠空間記憶能力得到改善，見圖1、表1。

圖1 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的運(yùn)動軌跡

表1 各組小鼠不同實(shí)驗(yàn)時間的行為學(xué)情況

2.2滌痰湯對tau蛋白磷酸化的影響 變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)異常磷酸化的tau蛋白聚集而形成的NFTs，這是AD的主要神經(jīng)病理特征之一。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦內(nèi)CA3區(qū)tau蛋白磷酸化水平顯著高于對照組大鼠，而滌痰湯組和西藥組大鼠腦內(nèi)的tau蛋白磷酸化水平較模型組有所降低。同時，在滌痰湯的作用下，灌胃組大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元凋亡減少，可見滌痰湯神經(jīng)保護(hù)作用顯著。Western blotting結(jié)果顯示，各組小鼠磷酸化tau蛋白表達(dá)水平中，模型組水平是對照組的(625.37±60.33)%，滌痰湯組是對照組的(167.95±23.57)%，西藥組是對照組的(179.62±36.86)%，模型組與對照組比較、滌痰湯組和西藥組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 滌痰湯對tau蛋白磷酸化的影響

2.3基于PKA/CREB信號通路探討滌痰湯對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 記憶能力障礙、失語健忘、認(rèn)知功能喪失及行為異常是AD最顯著的特征，患者晚期可出現(xiàn)意識模糊甚至昏厥等現(xiàn)象。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，tau作為微管相關(guān)蛋白，可經(jīng)過廣泛翻譯后修飾，而20多個不同表位的磷酸化位點(diǎn)大多數(shù)是蘇氨酸(pThr)或絲氨酸(pSer)。結(jié)果顯示，滌痰湯組和西藥組大鼠p-PKA及p-CREB表達(dá)高于模型組大鼠，但卻略低于對照組大鼠，見圖3、表2。

圖3 滌痰湯對PKA/CREB信號通路的影響

表2 各組小鼠p-PKA和p-CREB表達(dá)水平與對照組的比較

3 討 論

研究結(jié)果顯示，在以痰濁為患的多種病癥治療過程中，化痰益氣法具有較好的療效[4-6]。AD屬中醫(yī)老年呆病范疇，病機(jī)多以腎虛為本，以痰為標(biāo)。中醫(yī)理論認(rèn)為，痰濁與AD關(guān)系密切，且痰濁有臟腑虛衰相互作用，加速AD發(fā)病及進(jìn)展。老年人常有腎氣虛衰表現(xiàn)，腎虛水無所主，脾虛不運(yùn)水濕，而致濕濁內(nèi)停，濕聚生痰，痰擾清靈則昏蒙呆鈍。此外，關(guān)于痰濁促進(jìn)呆癥發(fā)病還有諸多文獻(xiàn)書籍記載，如《丹溪心法》描述“五志之火因七情而起，郁而成痰”進(jìn)而引發(fā)癲狂；《丹溪心法·健忘》提到“健忘者……亦有痰矣”；《石室秘錄》介紹“痰氣最盛，呆氣最深”，因此，“治呆無奇法，治痰即治呆也”。由上可見，基于“從痰論治”相關(guān)理論，祛痰、化濁開竅等功效的中藥可能成為AD的潛在治療手段。

臨床研究表明，滌痰湯可改善老年癡呆患者的臨床癥狀，且療效確切，但其作用機(jī)制尚不十分清楚[7]。滌痰湯是來自王肯堂的《證治準(zhǔn)繩》經(jīng)典方劑，由茯苓、半夏、膽星、竹茹、枳實(shí)、人參、石菖蒲、甘草、生姜等組成，其主要作用是滌痰開竅，益氣祛痰。此方中大多數(shù)藥物均能夠延緩癡呆的發(fā)生，滌痰湯治療AD療效顯著。如方中的石菖蒲，具有化濕開胃，開竅豁痰，醒神益智的功效，其活性成分可抑制膽堿能系統(tǒng)的酶活性；人參及其有效成分人參皂甙可起到抑制衰老、改善學(xué)習(xí)記憶功能等作用；半夏中的生物堿活性成分具有顯著的燥濕化痰，鎮(zhèn)咳化痰等作用；茯苓的主要生物活性成分具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫功能及鎮(zhèn)靜作用；枳實(shí)中的活性成分與多種中樞神經(jīng)疾病相關(guān)[8]。相關(guān)研究顯示，滌痰湯能夠改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[1-2]，還能降低乙酰膽堿酯酶(Ach E)的活性，并顯著改善中樞膽堿能系統(tǒng)乙酰膽堿(ACh)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性，進(jìn)而對AD所導(dǎo)致的中樞膽堿能系統(tǒng)受損具有保護(hù)作用[9]。由此可見，滌痰湯全方及組分中的藥物可以延緩AD的發(fā)生及發(fā)展。神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)由過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的NFTs是AD的神經(jīng)病理學(xué)改變之一[10]。過度磷酸化tau蛋白可促使tau異常定位至樹突，影響突觸信息傳遞并介導(dǎo)早期學(xué)習(xí)記憶損傷[11]。此外，tau蛋白異常磷酸化形成NFTs會促進(jìn)活性氧(ROS)產(chǎn)生，而ROS進(jìn)一步引起炎性反應(yīng)，間接影響神經(jīng)元突觸的正常功能并介導(dǎo)AD早期的學(xué)習(xí)記憶損傷[12-14]。因此，tau蛋白過度磷酸化在AD病變的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，可能是導(dǎo)致腦萎縮和癡呆癥狀發(fā)生的直接原因。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光、Western blotting及水迷宮方法考察了滌痰湯對AD模型大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的影響。研究結(jié)果表明，滌痰湯可明顯下調(diào)AD模型大鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平，且具有顯著的腦保護(hù)作用，最終改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

此外，研究顯示，PKA是cAMP最主要的效應(yīng)分子，位于細(xì)胞核內(nèi)的CREB主要調(diào)節(jié)啟動子中具有CRE的基因轉(zhuǎn)錄，屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。PKA/CREB信號通路在腦損傷及再生修復(fù)過程中扮演著重要角色，并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)表明，長時程記憶的過程需要合成新蛋白質(zhì)[15]，而在這一過程中，PKA/CREB信號通路發(fā)揮了重要作用[16-19]。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，在AD患者腦內(nèi)，CREB水平或者CREB活性的表達(dá)下調(diào)均可引起tau蛋白異常過度表達(dá)，表明CREB在tau基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中非常關(guān)鍵[20]。本研究通過Western blotting考察了滌痰湯改善模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的具體效果，結(jié)果顯示，滌痰湯組大鼠腦內(nèi)磷酸化PKA、CREB水平顯著高于模型組，提示滌痰湯可能激活PKA/CREB信號通路，上調(diào)了與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的蛋白水平，最終改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。