頸動脈支架植入術(shù)后血清長鏈非編碼RNA結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因水平及臨床意義

李 爽， 王建民， 胡沛霖

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者中約20%與頸動脈狹窄有關(guān)［1-2］，常引起頭暈?zāi)垦＃瑖?yán)重時甚至導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷和腦組織死亡［3-4］。常見因素有高血壓、糖尿病等慢性疾病，造成脂質(zhì)在頸動脈堆積，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)，促使頸動脈內(nèi)膜增厚，管腔變窄［5］。藥物治療和頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)為臨床主要治療手段，然而頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)創(chuàng)傷大、術(shù)后并發(fā)癥多，不適用于老年AIS患者［6］。頸動脈支架植入術(shù)微創(chuàng)，在改善頸動脈狹窄性AIS患者腦組織灌注量方面取得較好療效［7-8］，但術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)再次腦卒中或死亡［9］。早期評估術(shù)后患者預(yù)后情況并對危險因素進(jìn)行干預(yù)是改善預(yù)后的重要手段。雖然目前部分血清學(xué)標(biāo)志物如中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值及尿酸等，已用于預(yù)測AIS患者預(yù)后，但特異度較差，預(yù)測能力有限［10-11］。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）異常增殖、遷移可引起頸動脈內(nèi)膜變厚、管腔變窄，導(dǎo)致AIS發(fā)生發(fā)展［12］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）敲除可抑制血小板衍生生長因子-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移［13］。然而，有關(guān)LncRNA CRNDE在頸動脈狹窄性AIS中表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討頸動脈支架植入術(shù)后血清LncRNA CRNDE水平及其意義，以期為臨床評估患者預(yù)后提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2018年1月至2019年6月在邢臺市人民醫(yī)院接受頸動脈支架植入術(shù)治療的173例頸動脈狹窄性AIS患者作為研究對象。AIS診斷依據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》［14］標(biāo)準(zhǔn)。患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合AIS診斷標(biāo)準(zhǔn)且DSA檢查證實(shí)單側(cè)或雙側(cè)頸動脈狹窄程度≥70%；②凝血功能正常；③無阿司匹林和氯吡格雷禁忌證；④年齡＞18周歲；⑤接受早期溶栓治療；⑥簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎、肺功能障礙；②伴發(fā)顱內(nèi)動脈瘤或動脈畸形、動靜脈瘺等不能同時處理；③既往接受顱腦手術(shù)或頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)；④頸動脈鈣化嚴(yán)重。173例患者中男105例，女68例；年齡39～78歲，平均（64.8±7.6）歲。本研究獲邢臺市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（臨床審2018-070）。

收集患者性別、年齡、飲酒史、吸煙史、基礎(chǔ)疾病（高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病）、腦卒中分布及腦卒中病灶數(shù)等資料。

1.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測

抽取患者術(shù)后24 h內(nèi)空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，置于-80℃冰箱。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測血清LncRNA CRNDE相對表達(dá)量。TRIzol試劑提取血清中總RNA，將2μg總RNA添加至20μL反應(yīng)液中，采用TIANScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃5 min，95℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，45個循環(huán)。LncRNA CRNDE正向：5'-GUGCUCGAGUGGUUUA AAUTT-3'，反 向：5'-AUUUAAACCACUCGAGCA CTT-3'；內(nèi)參β-肌動蛋白（actin）正向：5’-GCUUA UCAGACUGAUUGA-3’，反向：5’-GTCAGTCGCT TGGGCTGT-3’。2-ΔΔCt表示LncRNA CRNDE相對表達(dá)量。

1.3 隨訪

采用電話或門診等方式隨訪，復(fù)查患者出院后90 d內(nèi)預(yù)后情況。采用改良Rankin量表（mRS）評分評估患者預(yù)后，mRS評分＜3分為預(yù)后良好，≥3分為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例或率［n（%）］表示，用卡方檢驗(yàn)。Logistic回歸法分析影響頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后的相關(guān)因素。多因素logistic回歸法建立模型A［出血轉(zhuǎn)化＋腦卒中病灶數(shù)評估患者預(yù)后（F=－1.435＋0.468×出血轉(zhuǎn)化＋0.374×腦卒中病灶數(shù)）、模型B［出血轉(zhuǎn)化＋腦卒中病灶數(shù)＋LncRNA CRNDE評估患者預(yù)后（F=-8.454+0.828×出血轉(zhuǎn)化-0.415×腦卒中病灶數(shù)+6.606×LncRNA CRNDE）。受試者工作特征曲線（ROC）分析LncRNA CRNDE、模型A、模型B評估患者預(yù)后的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

173例頸動脈狹窄性AIS患者支架植入術(shù)后預(yù)后不良發(fā)生率為39.88%（69/173），其中死亡2例（1.16%），重度殘疾14例（8.09%），中重度殘疾20例（11.56%），中度殘疾33例（19.08%）。預(yù)后不良組和預(yù)后良好組間患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、頸動脈扭曲、高脂血癥、高血壓、飲酒史、糖尿病、吸煙史、冠心病、發(fā)病部位比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；出血轉(zhuǎn)化、腦卒中病灶數(shù)、同型半胱氨酸比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。預(yù)后不良組患者血清LncRNA CRNDE相對表達(dá)量為（1.35±0.34）%，高于預(yù)后良好組［（0.93±0.19）%］，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.395，P＜0.001）。

表1 兩組基線資料比較

將出血轉(zhuǎn)化（無=0，有=1）、腦卒中病灶數(shù)（單發(fā)=0，多發(fā)=1）、同型半胱氨酸、LncRNA CRNDE作為自變量（α入=0.05，α出=0.1），頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后情況（預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1）作為因變量納入logistic回歸分析，結(jié)果顯示出血轉(zhuǎn)化、腦卒中病灶數(shù)、LncRNA CRNDE與頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后關(guān)系密切，見表2；LncRNA CRNDE與模型A評估AIS患者預(yù)后的ROC曲線下面積（AUC）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.043，P=0.297），模型B評估頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后的效能高于LncRNA CRNDE和模型A（Z=2.603，P=0.009；Z=2.945，P=0.003），見表3、圖1。

表2 影響頸動脈狹窄性AIS患者支架植入術(shù)后預(yù)后的因素

表3 LncRNACRNDE、模型A及模型B評估頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后的效能

圖1 LncRNA CRNDE、模型A及模型B評估頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后ROC曲線

3 討論

LncRNA是主要存在于核內(nèi)的一類新型非編碼RNA［15］。已有研究證實(shí)多種lncRNA參與AIS發(fā)生發(fā)展過程［16-17］。LncRNA CRNDE在結(jié)直腸癌患者中差異表達(dá)，可調(diào)控染色質(zhì)表觀遺傳，并具有調(diào)節(jié)組蛋白甲基化/非甲基化狀態(tài)的作用，已在多種癌組織和癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)［18-19］。近來相關(guān)研究顯示，LncRNA CRNDE在大鼠動脈球囊損傷后表達(dá)升高，并調(diào)節(jié)VSMC增殖、遷移和表型變化，而VSMC異常表達(dá)與頸動脈狹窄導(dǎo)致的AIS關(guān)系密切［13］。有關(guān)LncRNA CRNDE在頸動脈狹窄性AIS中表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究在隨訪支架植入術(shù)后頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后情況中，比較不同預(yù)后患者血清LncRNA CRNDE相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組患者LncRNA CRNDE相對表達(dá)量高于預(yù)后良好組，表明LncRNA CRNDE可能與患者支架植入術(shù)后預(yù)后存在聯(lián)系。為進(jìn)一步明確血清LncRNA CRNDE與頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后的關(guān)系，通過logistic多因素分析影響患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示出血轉(zhuǎn)化、腦卒中病灶數(shù)與頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后關(guān)系密切，與既往研究相符［20-21］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE與頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后關(guān)系密切。

VSMC異常增殖、遷移可造成頸動脈狹窄并引起AIS［11］。VSMC是血管壁重要組成部分，主要在動脈血管中膜形成，具有構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)和維持血管張力的作用［22］。VSMC有收縮型和合成型兩種表型，正常情況下以收縮型存在，受到外界刺激后轉(zhuǎn)化為合成型并分泌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶、骨保護(hù)素及堿性磷酸酶等細(xì)胞因子，促進(jìn)VSMC增殖、遷移，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展［23］。動脈粥樣硬化早期VSMC凋亡減少，導(dǎo)致血管內(nèi)膜和中膜動脈血管中VSMC大量聚集，進(jìn)而引起動脈粥樣硬化性血管重構(gòu)，加劇動脈粥樣硬化發(fā)展［24］。基礎(chǔ)研究表明，LncRNA CRNDE可抑制VSMC增殖、遷移，且LncRNA CRNDE基因敲除后可逆轉(zhuǎn)VSMC表型改變［13］。因此本研究推測LncRNA CRNDE可能通過調(diào)節(jié)VSMC增殖、遷移參與頸動脈狹窄性AIS疾病進(jìn)程。

本研究同時通過血清LncRNA CRNDE、模型A及模型B評估頸動脈狹窄性AIS患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型B評估患者預(yù)后的效能高于LncRNA CRNDE及模型A，表明增加LncRNA CRNDE有助于評估患者預(yù)后。

綜上所述，LncRNA CRNDE與頸動脈狹窄性AIS患者支架植入術(shù)后預(yù)后關(guān)系密切，檢測血清LncRNA CRNDE表達(dá)有助于評估患者預(yù)后。本研究下一步將動態(tài)檢測血清LncRNA CRNDE表達(dá)情況并進(jìn)行基礎(chǔ)研究，分析LncRNA CRNDE影響頸動脈狹窄性AIS患者支架植入術(shù)后預(yù)后的病理生理機(jī)制。