亞慢性硝酸釔暴露對雌性大鼠學習記憶能力的影響

王佳敏，劉建新，孟慶賀，郝衛東*

(北京大學公共衛生學院毒理學系，食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京100191)

稀土元素(rare earth elements，REEs)是指元素周期表中ⅢB族中的17種化學元素。稀土廣泛應用于工業、農業、畜牧業、醫藥業等行業，是我國重要的戰略資源。近幾年，稀土元素在茶葉中的暴露情況受到廣泛關注。稀土微肥通常作為葉面肥使用，農用稀土肥料主要采用較易溶解于水的稀土元素硝酸鹽類化合物，使得稀土元素進入了各種茶葉中，農用稀土通過茶樹的根莖等進入葉片部分進行富集并在葉片中殘留，致使普通人群日益頻繁地接觸到稀土元素。研究表明茶葉中稀土元素鈰(Ce)、鑭(La)、釔(Y)的平均含量相對較高。

釔在地殼中的質量豐度約為33 mg/kg，是稀土元素中含量最豐富的元素之一。自然界40%的釔存在于中國，主要分布于中國東北、湖南、兩廣、滇川和西北。釔是第一個被發現的稀土金屬元素，可用于制特種玻璃和合金。常見化合物是氧化釔和鹵化釔，與其他元素化合主要呈正二價或正三價態，所形成的化合物具有高熔點、熱穩定性好以及良好的發光輻射性能等特點。

以往關于稀土元素的神經毒性研究，關注鑭元素較多，釔及其化合物相對較少。已有的一些研究發現，釔及其化合物能夠破壞血腦屏障、促進神經細胞過度凋亡、改變神經遞質含量、損傷學習記憶能力，對神經系統造成損傷。本研究通過觀察硝酸釔亞慢性(90 d)暴露對大鼠學習記憶能力的影響，以谷氨酸(glutamate，Glu)及N-甲基-D-冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)蛋白表達為基礎探究其可能的作用機制，旨在為稀土元素釔的風險評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本研究的主要試劑有：硝酸釔(Ⅲ)四水合物[Yttrium(Ⅲ)nitrate tetrahydrate，Y(NO)·4HO，純 度99.99%，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司]，NMDA R1抗 體 和NMDA R2A抗 體(英 國Abcam公司)，NMDA R2B抗體、大鼠谷氨酸比色法測試盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司)，BCA蛋白檢測試劑盒(中國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實驗儀器

本研究使用的實驗儀器有：高速冷凍離心機(Sigma 3-18KS型，德國Sartorius公司)；多功能組織勻漿儀(FastPrep-24型，美國MP Biomedicals公司)；超聲細胞破碎儀(VIRSONIC 100型，美國VIRTIS公司)；垂直凝膠電泳系統(Mini-PROTEN Tetra cell型，美國Bio-Rad公司)；化學發光凝膠成像分析系統(MINI HD9型，英國UVITEC公司)；微量分光光度計(NanoPhotometer N50 Touch型，德 國IMPLEN公 司)；正置熒光顯微鏡(BX43型，日本Olympus公司)。

1.3 實驗動物處理

選用剛離乳(PND21)的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD大 鼠，質 量45～55 g，雌性，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，動物使用許可證號：SCXK(京)2016-0010。動物飼養于屏障環境中，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。光照條件為12 h/12 h明暗交替循環，動物自由飲水及進食。動物實驗符合動物福利和北京大學動物倫理委員會相關規定并通過倫理委員會審查。

參照經濟合作與發展組織(OECD)GD-424推薦的動物神經行為毒性評價實驗方法。大鼠在5 d適應期后，根據體質量隨機分為4組，分別為對照組(ddHO)，Y(NO)低 劑 量 組(10 mg/kg)、中 劑 量 組(40 mg/kg)和高劑量組(160 mg/kg)，每組15只。

1.4 行為學實驗

1.4.1 曠場實驗

將體積為100 cm(長)×100 cm(寬)×50 cm(高)的曠場裝置放置在隔音的房間內，嚴格控制室內溫度和通風，選用弱光照明。實驗者與設備保持一定距離。將動物放置于曠場中央，曠場地面被分成若干網格，記錄5 min內動物的活動參數：水平運動距離、垂直運動距離、直立次數、梳理次數，以及動物的典型行為(如舔、咬等)的次數。分別以曠場中央和周圍來計算以上指標，動物在中央的活動次數反映了焦慮程度，即中央活動次數越多焦慮越少。

1.4.2 高架十字迷宮

高架十字迷宮包括兩個開放臂和兩個封閉臂，四者形成十字的形狀，每個臂長47 cm，寬15 cm，兩個封閉臂有高40 cm的壁。動物置于迷宮中央，面向其中一個開放的臂。讓動物自由探索四個臂5 min，記錄動物第1次進入任何臂的潛伏期，以動物四肢都進入一個臂算作進入1次。每只動物只檢測1次，如果在試驗過程中動物跌落，則淘汰該數據。計算動物進入開臂次數和在開臂滯留時間分別占總次數(進入開臂和閉臂次數之和)和總時間(在開臂和閉臂滯留時間之和)的百分比，以此作為評價焦慮的指標。

1.4.3 轉棒實驗

轉棒實驗的裝置為無頂木箱，箱內有可轉動的防滑材質的轉棒。試驗前1 d，將大鼠置于轉棒上以4 r/min的速度適應60 s，直到大鼠在轉棒上60 s不跌落。測試當天，將大鼠置于轉棒上，300 s內轉速從4 r/min加速到40 r/min。記錄大鼠從竿上跌落的旋轉速度和潛伏期，并取3次試驗的平均值。

1.4.4

Morris

水迷宮實驗

實驗裝置放置在安靜寬敞的房間內，在墻壁上懸掛一些圓形、三角形等物體作為動物的視覺線索。在設備周圍拉上黑色圍簾以阻隔實驗者和受試動物。將實驗裝置分為4個象限，內注入自來水，水高23 cm，水溫保持在(25.0±1.0)℃；于其中西北(NW)象限中心置一圓形平臺，直徑10 cm，位于水面下1.5～2.0 cm。實驗包括：①定位航向實驗：平臺置于水面下1.5～2.0 cm，將大鼠隨機地頭朝池壁，按東北(NE)、西北(NW)、東南(SE)、西南(SW)4個入水點輕輕放入水池中。每次試驗中每只大鼠最多游泳90 s，讓其找到水中隱藏的平臺，記錄大鼠自入水至找到平臺四肢爬上平臺所需的時間，作為逃避潛伏期。大鼠爬上平臺后，讓其停留30 s；若入水后給定時間內未能找到平臺或未能爬上平臺，則將時間記錄為90 s，并且將其人為放置于平臺上30 s，然后從平臺上取下休息30 s，再進行下一次訓練。按此方法每只動物每天訓練4次，連續訓練4 d。②空間探索實驗：最后一次定位航行實驗后24 h，撤除平臺。將動物從任一隨機象限放入水中追蹤其運動軌跡60 s，連續測試兩次；記錄動物目標象限(原先放置平臺的象限)的游泳時間、游泳距離、進入目標象限的次數，以及穿過原平臺位置的次數。

1.5 谷氨酸含量檢測

行為學檢測后，采用股動脈放血法處死動物，迅速斷頭取腦，冰上快速分離出大腦皮質和雙側海馬，-80℃冰箱凍存待用。使用大鼠谷氨酸比色法測試盒，按照試劑盒說明書操作，檢測雌鼠大腦皮質和海馬中谷氨酸的含量。

1.6 N-甲基-D-天冬氨酸受體蛋白表達檢測

采用Western blot法。取0.05 g海馬組織加入300 μL RIPA(臨用前按1∶100加入PMSF)，勻漿儀破碎組織，4℃14 000g離心5 min，取上清，PBS稀釋后，用BCA法測定總蛋白濃度，-80℃冰箱凍存。經8% SDS-PAGE分離后，轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST緩沖液洗滌后，一抗稀釋液孵育，4℃水平輕搖過夜。所用抗體滴度：β-actin、NMDA R2A、NMDA R2B均為1∶1 000，NMDA R1為1∶5 000。TBST洗滌后，抗兔二抗稀釋液(滴度1∶2 000)室溫下孵育2 h。ECL發光，運用化學發光凝膠成像分析系統采集圖片，ImageJ軟件測定條帶像素值，以β-actin為內參蛋白，計算得到目的蛋白的相對表達量。

1.7 大鼠腦組織病理組織學檢查

各暴露組取5只雌鼠，進行原位灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液中浸泡固定腦組織24 h。經梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，對腦組織標本進行石蠟包埋，連續冠狀切片后進行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下對腦組織進行組織病理學檢查。

1.8 統計分析

數據以

x

ˉ±

s

表示，采用SPSS 22.0進行統計分析。采用雙因素重復測量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)比較定位航向實驗的學習曲線(劑量組×訓練天數)。對于其他指標數據的統計分析，各劑量組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，實驗組與對照組間采用LSD-

t

檢驗進行兩兩比較。統計學檢驗水準為α=0.05，

P

＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學實驗結果

見表1。硝酸釔90 d暴露后，曠場實驗結果顯示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠的水平運動距離、直立次數、梳理次數、中央區運動時間差異均無統計學意義(

P

＞0.05)；高架十字迷宮實驗結果顯示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠的進入開臂次數[進入開臂次數/(進入開臂次數+進入閉臂次數)]、進入開臂時間(進入開臂時間/總時間)、開臂中運動距離(開臂中運動距離/總運動距離)的百分比差異均無統計學意義(

P

＞0.05)；轉棒實驗結果顯示，與對照組相比，160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠的在棒時間、在棒圈數、掉落速度均明顯升高(

P

＜0.05)。

表1 硝酸釔90 d暴露對雌鼠行為學實驗結果的影響(n=10)

2.2 Morris水迷宮實驗結果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠定位航向實驗結果的影響如圖1所示，隨著訓練時間的延長，與第1天相比，對照組及各硝酸釔暴露組大鼠的逃避潛伏期與總航行距離均明顯降低(

P

＜0.05)。與對照組相比，訓練第4天時，40、160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(

P

＜0.05)。

圖1 硝酸釔90 d暴露對雌鼠定位航向實驗結果的影響(n=10)

硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實驗結果的影響如表2所示，與對照組相比，40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠穿越平臺次數、目標象限游泳時間、目標象限游泳時間百分比(目標象限游泳時間/總時間)時間明顯升高(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠穿越平臺次數、進入目標象限次數、目標象限游泳時間明顯升高(

P

＜0.05)；各硝酸釔暴露組大鼠的目標象限游泳時間、目標象限游泳距離、目標象限游泳距離百分比(目標象限游泳距離/總游泳距離)、總游泳距離、游泳平均速度差異均無統計學意義(

P＞

0.05)。

表2 硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實驗結果的影響(n=10)

硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實驗各個象限結果的影響如圖2所示，與目標象限NW象限的逃避潛伏期相比，對照組大鼠NE、SE象限的逃避潛伏期明顯高于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)；40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠SW象限的逃避潛伏期明顯低于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠NE、SW、SE象限的逃避潛伏期明顯低于NW象限的逃避潛伏期(

P

＜0.05)。

圖2 硝酸釔90 d暴露對雌鼠空間探索實驗各個象限中結果的影響(n=10)

2.3 大鼠腦谷氨酸含量檢測結果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠大腦皮質及海馬中Glu含量的影響如圖3所示，與對照組相比，各硝酸釔暴露組大鼠大腦皮質中Glu含量差異均無統計學意義(

P＞

0.05)；而160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中Glu含量顯著降低(

P

＜0.05)。

圖3 硝酸釔90 d暴露對雌鼠大腦皮質及海馬中Glu含量的影響(n=10)

2.4 離子型谷氨酸受體蛋白表達檢測結果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬中NMDA受體R1、R2A、R2B蛋白表達的影響如圖4所示，與對照組相比，40 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中NMDA受體R2A含量和160 mg/(kg·d)硝酸釔暴露組大鼠海馬中NMDA受體R1、R2A含量均顯著降低(

P

＜0.05)。

圖4 硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬中NMDA受體蛋白表達的影響(n=10)

2.5 大鼠海馬組織HE染色結果

硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬組織結構的影響如圖5所示。在光學顯微鏡下進行病理組織學檢查，與對照組相比，各硝酸釔暴露組海馬組織均未見形態學異常現象，海馬各區神經元呈圓形、橢圓形或錐形，細胞核為原型或橢圓形，著色均勻為淺藍紫色，核仁明顯，神經元數量正常；其中錐體細胞、齒狀回顆粒細胞排列整齊，細胞輪廓于周圍組織分界清晰。海馬神經元形態基本完整，分布規則，數量無明顯變化，細胞核未見明顯異常。此結果提示硝酸釔90 d暴露不會對雌鼠海馬組織造成病理學改變。

圖5 硝酸釔90 d暴露對雌鼠海馬組織結構的影響(×400)

3 討論

Morris水迷宮由英國生理學家Morris于1984年發明，目的是用于評估嚙齒動物的腦學習記憶，目前被廣泛應用于評價動物的空間學習與記憶能力。本研究結果顯示，定位航行實驗的第4天訓練中，與對照組相比，40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的逃避潛伏期均顯著降低(

P

＜0.05)。空間探索實驗中，與對照組相比，40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的穿越原平臺所在位置次數、目標象限中游泳時間均顯著升高(

P

＜0.05)，說明中、高劑量組雌鼠對原平臺所在位置的記憶更加深刻。對于空間探索實驗的逃避潛伏期，各劑量組雌鼠在不同象限中的停留時間有所差異。對照組雌鼠在目標象限中停留時間顯著低于另外兩個象限，而160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠在目標象限中停留時間顯著高于剩余3個象限，由此可見對照組雌鼠對原平臺位置的記憶能力低于160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠。本研究結果提示40、160 mg/(kg·d)劑量的硝酸釔亞慢性暴露可引起雌性大鼠空間學習記憶能力的增強，且隨著暴露劑量的增高，大鼠的學習記憶能力也隨之增高。學習和記憶是機體大腦的復雜神經生理活動，而海馬對于空間記憶的產生與維持具有重要意義。海馬中谷氨酸(Glu)是重要的興奮性神經遞質，可以激活突觸后膜上NMDA受體(NMDARs)，此過程與神經元突觸可塑性、學習記憶功能密切相關。一般認為，NMDA受體表達減少可能導致大鼠空間學習記憶能力的減弱，但本研究結果顯示，硝酸釔的亞慢性(90 d)暴露促進了雌性大鼠的空間學習記憶能力，與對照組相比，160 mg/(kg·d)劑量組海馬中Glu含量顯著降低，40 mg/(kg·d)劑量組海馬中R2A含量顯著降低(

P

＜0.05)；160 mg/(kg·d)劑量組海馬中R1、R2A含量顯著降低(

P

＜0.05)，因此關于硝酸釔影響雌性大鼠學習記憶功能的機制仍需要進一步深入研究。另外，近年來由于NMDA受體過度活化與多種中樞神經系統疾病存在密切關系，對開發靶向NMDA受體的藥物一直備受重視。多項研究表明，NMDAR拮抗劑在動物已經獲得學習記憶后給藥，在大鼠進行Morris水迷宮訓練后，將NMDAR拮抗劑注入大鼠海馬，可以提高大鼠在Morris水迷宮實驗中的空間記憶能力。因此，抑制NMDA受體表達也有可能保護大鼠對空間學習記憶能力的維持，但是這與硝酸釔影響雌性大鼠神經行為功能的機制是否有關，仍需要進一步的探索。

本研究根據OECD424準則，評價硝酸釔對雌性大鼠學習記憶能力的影響，發現40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠的空間學習記憶能力提高，160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠海馬組織中Glu含量與NMDA R1受體蛋白表達均顯著降低；40、160 mg/(kg·d)劑量組雌鼠海馬組織中NMDA R2A受體蛋白表達顯著降低，提示硝酸釔亞慢性暴露引起雌性大鼠空間學習記憶能力增強的機制，可能與海馬組織中Glu含量降低、NMDA受體表達減少有關。