磷酸三苯酯對小鼠巨噬細胞Raw264.7的毒性及吞噬功能的影響

張梓涵，李 麗，張文鋒，張艷超，陳慧玲，石 明，2，*

(1．廣東醫科大學公共衛生學院，東莞市環境醫學重點實驗室，廣東 東莞523808；2．廣東醫科大學寮步醫院，廣東 東莞523400)

隨著鹵代阻燃劑在全球范圍內被逐步禁用，有機磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants，OPFRs)因其價格低、品種多、阻燃效果好等優點，被應用于建筑材料、家具、紡織用品、電子產品等行業，并廣泛存在于生態環境中。磷酸三苯酯(triphenyl phosphate，TPHP)是一種典型的芳香基OPFRs，在各類工業產品中被廣泛用作增塑劑和阻燃劑。但是，TPHP具有較高的揮發性和親脂性，在生產和使用過程中容易從材料中通過揮發、滲出等方式釋放，并持久存在于環境中。由于TPHP難降解，在環境中存留時間較長，在生物體內具有富集效應，對人體健康和環境安全具有較大威脅，其毒性研究受到了人們的廣泛關注。

免疫系統作為機體執行免疫應答及免疫功能的重要系統，參與協助各系統發揮正常的生理功能，對外源性化學物較敏感。TPHP可引起某些免疫細胞的損傷，誘導過敏性接觸性超敏反應，但目前對其引發的具體免疫毒性作用及機制尚未見報道。巨噬細胞是構成機體免疫系統的重要組成部分之一，具有趨化性運動、吞噬、分泌和抗原呈遞等功能，在巨噬細胞吞噬過程中，最為顯著的特點是在吞噬體周圍出現絲狀肌動蛋白F-actin的局部快速積聚與相關蛋白在吞噬體周圍分布。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是巨噬細胞的表面模式識別受體之一，被激活后可誘導巨噬細胞釋放炎性細胞因子，啟動巨噬細胞的免疫防御功能和吞噬功能。TLR4的激活能夠引起磷脂酰肌醇-3-激 酶(PI3K)-絲/蘇 氨 酸 激 酶(serine/threonine kinase，Akt)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號軸的激活，其中PI3K/Akt信號通路在調節細胞活化、炎癥反應、細胞存活和凋亡中發揮著中心作用。

因此，本研究以小鼠巨噬細胞系Raw264.7為研究對象，通過檢測TPHP對巨噬細胞的存活率、細胞毒性和吞噬功能的影響，探討TPHP暴露對免疫系統的毒性作用和潛在機制，為TPHP暴露對免疫系統影響和毒性風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、CCK-8試劑均購自Gibco公司；乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)購自Promega公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購 自Sigma公 司；TLR4、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR抗體購自Cell Signaling Technology公司；ECL發光液購自ThermoFisher Scientific公司；Phagocytosis Assay Kit(IgG-FITC)購自Cayman公司。

1.2 細胞系和細胞培養

小鼠巨噬細胞系Raw264.7為廣東醫科大學閆沖教授惠贈。在含有10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、CO體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中靜置培養。定時觀察培養基顏色和細胞狀態，及時更換新鮮培養基和傳代培養。將細胞培養至貼壁狀態，于普通光學顯微鏡下觀察并拍攝細胞的形態和偽足。

1.3 CCK-8比色法檢測TPHP對Raw264.7細胞活性的影響

取對數生長期的Raw264.7細胞，按照每孔5×10個細胞加入到96孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度(12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)的TPHP溶液處理細胞。對照組每孔加入等體積的DMEM培養液。在細胞培養箱中繼續培養24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑并在37℃培養箱中繼續孵育3 h。使用酶標儀檢測吸光度

D

(450)。按如下公式計算細胞存活率：

1.4 乳酸脫氫酶釋放法檢測細胞毒性

將Raw264.7細胞以5×10/孔加入到96孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度(12.5、25、50、100、200、400 μmol/L)的TPHP溶液處理細胞，對照組每孔加入等體積的培養液，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)最大釋放量組則在加CytoTox 96試劑前45 min加入10 μL的10×裂解液。在細胞培養箱中繼續培養24 h、48 h或72 h后，將所有待測孔的50 μL上清液轉移至新的96孔板中，再加入50 μL CytoTox 96Reagent檢測液，室溫避光孵育30 min后，每孔加入50 μL終止液，使用酶標儀讀取490 nm波長處的吸光度值

D

(490)。LDH釋放率用如下公式計算：

1.5 熒光微球法測定Raw264.7細胞吞噬功能

將Raw264.7細胞均勻接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)的TPHP繼續孵育24 h，加入FITC標記的熒光微球(用含5% BSA的TBST緩沖液按1∶500稀釋)，在培養箱中繼續孵育4 h，期間每隔30 min振動培養板。棄去培養基，用1 mL預冷的PBS洗滌細胞后，加入0.2%臺盼藍淬滅吸附在細胞表面的熒光，再用預冷的PBS洗滌細胞兩次，采用流式細胞術測量吞噬熒光微球陽性細胞的數目及比例。

1.6 Western blot檢測各蛋白的表達

不同濃度(0、12.5、25和50 μmol/L)TPHP處理Raw264.7細胞24 h后，用PBS洗滌細胞2次，再加入細胞裂解混合液(細胞裂解液、磷酸酶抑制劑、PMSF的體積比為100∶1∶1)，冰上裂解30 min后刮取細胞，超聲充分破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。各組取30 μg的蛋白于5%的濃縮膠、8%的分離膠進行電泳，電壓調至80 V，當樣品進入分離膠，更換100 V電壓。電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉PVDF膜2 h后，分別加入mTOR、p-mTOR、TLR4、Akt、p-Akt和βactin抗體，4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的山羊抗兔二抗孵育1 h后，用TBST洗膜3次。最后加入ECL發光液進行顯影。使用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，數據采用

x

ˉ±

s

表示。兩組間比較采用

t

檢驗，3組及以上采用單因素方差分析，率的比較采用

χ

檢驗，檢驗水準α=0.05，

P

＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TPHP對Raw264.7細胞活性的影響

CCK-8比色法檢測結果如圖1所示。當TPHP作用24 h時，200和400 μmol/L的TPHP對細胞活力的抑制率超過50%，而12.5、25、50 μmol/L的TPHP未引起明顯的細胞毒性作用(圖1A)。當作用時間達到48 h，50 μmol/L及以上濃度的TPHP可顯著抑制細胞的存活率(

P

＜0.05，圖1B)。當作用時間達到72 h，即使最低濃度的TPHP(12.5 μmol/L)也可引起巨噬細胞存活率明顯下降(

P

＜0.05，圖1C)。TPHP對Raw264.7細胞的毒性作用呈劑量依賴性(

r

=0.960，

P

＜0.05)和時間依賴性(

r

=0.980，

P

＜0.05)。以上結果說明隨著TPHP濃度和作用時間的增加，Raw264.7細胞的存活率逐漸降低。

圖1 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細胞不同時間的細胞存活率比較

2.2 TPHP對Raw264.7細胞LDH釋放的影響

正常狀態下，LDH存在于細胞質中。當細胞膜的磷脂雙分子層結構的完整性被破壞后，LDH會穿過不完整的細胞膜滲漏到培養液中，通過檢測細胞培養上清中的LDH活性，可以反映細胞的損傷程度。LDH釋放率檢測結果如圖2所示。與對照組相比，50～400 μmol/L組Raw264.7細胞培養基中LDH水平均明顯升高(

P

＜0.05)。從作用時間來看，TPHP作用72 h后，即使是25 μmol/L的TPHP也會導致Raw264.7細胞培養液中的LDH水平升高(

P

＜0.05)。以上結果說明TPHP對Raw264.7細胞具有明顯的細胞毒性。

圖2 不同濃度的TPHP處理Raw264.7細胞不同時間的LDH釋放率比較

2.3 TPHP引起Raw264.7細胞形態改變

采用普通光學顯微鏡觀察TPHP處理Raw264.7細胞24 h后的形態變化，結果如圖3所示。對照組細胞呈規則圓形，體積小，貼壁緊密，生長狀態良好(圖3A)。低濃度(25 μmol/L)TPHP處理后，細胞形態與對照組相比無明顯的差異，說明低濃度TPHP對細胞結構損害較小，這與CCK-8檢測結果一致(圖3B)。當TPHP細胞濃度達到100 μmol/L，有較多細胞的細胞膜向外延伸呈不規則形，細胞呈長梭形，伸出較多偽足(圖3C)。以最大濃度(400 μmol/L)TPHP處理后，大多數細胞的細胞膜向外延伸呈不規則形，有大量偽足(圖3D)，說明高濃度的TPHP暴露會引起Raw264.7細胞發生分化。

圖3 不同濃度TPHP處理Raw264.7細胞24 h后的細胞形態變化(×40)

2.4 TPHP能夠增強Raw264.7細胞吞噬作用

當TPHP的濃度≤50 μmol/L時對Raw264.7細胞的毒性較小，同時考慮染毒時間過長會對細胞造成非毒性傷害，造成實驗結果的偏倚，故選擇TPHP濃度為50 μmol/L、染毒時間為24 h進行后續巨噬細胞吞噬作用及相關蛋白表達水平的測定。巨噬細胞的吞噬作用在維持非特異性免疫的穩態中發揮重要作用。本研究采用熒光微球法測定巨噬細胞的吞噬能力，結果如圖4所示。與對照組相比，當TPHP濃度為25和50 μmol/L時，FITC-A細胞的比例顯著增加，說明較高濃度的TPHP能夠增強Raw264.7細胞的吞噬作用。

圖4 熒光微球法檢測不同濃度TPHP處理Raw264.7細胞24 h后的吞噬能力

2.5 TPHP促進TLR4的表達及Akt、mTOR的磷酸化

TLR4是Toll樣受體家族的成員，表達于巨噬細胞膜上，在巨噬細胞發揮先天免疫激活中起重要作用。Western blot檢測結果見圖5，顯示隨著TPHP濃度的升高，TLR4的表達水平亦升高，與對照組相比，12.5～50 μmol/L TPHP處理組TLR4的表達差異均有統計學意義(

P

＜0.05或

P

＜0.01)，說明不同濃度的TPHP均能夠激活巨噬細胞表面TLR4的表達。為了進一步研究TPHP對巨噬細胞活性和功能的影響，本研究還檢測了TPHP處理24 h后Akt和mTOR的表達情況，結果顯示TPHP可以促進Akt和mTOR的磷酸化(

P

＜0.05)。以上結果表明TPHP可引起免疫相關蛋白的變化。

圖5 不同濃度的TPHP對Raw264.7細胞mTOR、TLR4和Akt蛋白表達的影響

3 討論

本研究以Raw264.7細胞作為研究對象，分析不同濃度TPHP在不同作用時間下的細胞毒性，通過普通光學顯微鏡觀察，借助流式細胞術檢測巨噬細胞吞噬熒光微球的能力，結合Western blot驗證TLR4蛋白表達水平和Akt和mTOR的磷酸化水平。結果表明，TPHP對Raw264.7細胞具有明顯的細胞毒性，誘導細胞伸出偽足，增強巨噬細胞吞噬功能，同時引起上述蛋白表達升高或觸發磷酸化水平。

由于TPHP通常以添加劑的形式存在于終產品中，很容易被釋放到自然界中。TPHP較難被降解，最終可通過空氣、水等媒介進入人體，并在人體內蓄積，產生潛在毒性作用。目前在室內空氣、灰塵、土壤、污水處理廠排放液等環境介質中均已檢測到了TPHP。研究顯示，TPHP的暴露會對浮游生物、魚類、底棲生物等造成傷害，如能夠抑制斜生柵藻和小球藻的生長，導致稀有鮈鯽肝臟組織病理學變化、血腦屏障被破壞，使斑馬魚發育畸形、視力受損并干擾游泳行為等。環境介質中的TPHP可通過呼吸、飲食、皮膚等進入機體，在人或動物體內蓄積，并對內分泌系統、肝臟、腎臟、生殖系統和神經系統造成極大的威脅。陳敏等采用氣相色譜測定了TPHP通過尾靜脈暴露昆明小鼠后的組織分布，發現TPHP主要蓄積在小鼠脾臟、肝臟和腎臟中。研究顯示，TPHP對機體多個系統具有毒性效應。

巨噬細胞是機體重要的免疫效應細胞，具有免疫防疫、免疫監視、免疫調節、抗原呈遞等功能，在維持機體內環境穩態和抵御微生物入侵過程中發揮重要作用。由于巨噬細胞已經成功建系，體外傳代培養方法均已成熟，因此本研究選擇Raw264.7細胞系作為研究對象，探討TPHP對巨噬細胞的毒性作用。本研究結果顯示，隨著TPHP暴露濃度和作用時間的增加，TPHP呈現明顯的毒性作用(

P

＜0.05)。當作用時間為24 h時，較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP無明顯細胞毒性，但是當作用時間達到72 h時，低濃度的TPHP也會顯著影響細胞的存活率。An等的研究發現高濃度(150和200 μmol/L)的TPHP可導致A549細胞和Caco-2細胞的存活率降低，而低于100 μmol/L的TPHP則對細胞存活率無明顯影響。Canbaz等發現濃度高于50 μmol/L的TPHP對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞具有明顯細胞毒性。以上研究與我們的檢測結果基本一致。

吞噬能力是反映巨噬細胞免疫防御能力的一個重要指標。我們測定了較低濃度(12.5、25和50 μmol/L)的TPHP作用24 h對巨噬細胞吞噬功能的影響。本研究結果發現25和50 μmol/L的TPHP能增強Raw264.7細胞的吞噬功能。TLR4是巨噬細胞膜上大量表達的模式識別受體，其異常激活后會引發巨噬細胞釋放炎癥介質，從而激活固有和獲得性免疫系統來清除異物。本研究檢測結果發現TPHP能夠促進細胞膜表面TLR4的表達。TLR4可以通過PI3K/Akt信號通路調節機體的免疫反應，參與細胞的生長、增殖、分化和運動。PI3K是細胞內的重要信號傳導分子，激活后的PI3K可以作為第二信使激活Akt，活化的Akt可以調節下游的效應因子mTOR，進而影響固有免疫細胞的生存、遷移和分泌相關炎癥因子。在免疫細胞中，mTOR調節新陳代謝以決定細胞的活性、增殖和效應功能。本研究顯示TPHP可促進Raw264.7巨噬細胞Akt和mTOR的磷酸化，說明TPHP能夠通過TLR4/Akt/mTOR信號通路影響巨噬細胞的功能。研究顯示，PI3K/Akt信號通路能夠進一步激活下游的mTOR，而mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在維持機體免疫穩態中發揮著重要的作用，能夠影響固有免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞等的增殖、遷移和效應功能。Lee等的研究結果指出，TLR4-mTORC1調控膜脂質筏和肌動蛋白細胞骨架之間的聚合與解聚，介導巨噬細胞吞噬作用。但是，本研究僅檢測了TPHP對巨噬細胞Raw264.7的細胞毒性、吞噬功能以及TLR4、Akt和mTOR蛋白的表達，并未驗證相關信號通路的作用。因此，在后續研究中將會使用阻斷劑來檢測TPHP是否通過影響TLR4/Akt/mTOR信號通路進而影響巨噬細胞的吞噬作用等功能。

綜上所述，本研究采用不同濃度TPHP處理巨噬細胞，發現TPHP可抑制巨噬細胞的活力、損傷細胞膜的完整性，還可引起TLR4蛋白表達水平升高，Akt和mTOR磷酸化水平升高，通過TLR4、Akt和mTOR蛋白調控巨噬細胞的功能，為進一步研究TPHP誘導Raw264.7巨噬細胞功能改變的機制奠定了基礎，也為OPFRs的污染防控提供了基礎參考數據。