利拉魯肽對脲鏈佐菌素誘導阿爾茨海默病大鼠認知功能及Tau蛋白磷酸化的影響

趙 麗，王 莉，莫 玲，孫 艷，*

(1．哈爾濱醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室，黑龍江 哈爾濱150081；2．哈爾濱醫科大學附屬第二醫院老年病科，黑龍江 哈爾濱150001；3．桂林醫學院公共衛生學院，廣西 桂林541199)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種能導致嚴重殘疾和死亡的慢性疾病，臨床上以進行性認知功能障礙為特征，其典型病理特征是細胞外淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積形成的老年斑及細胞內過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經元纖維纏結。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種由胰島信號通路障礙導致的內分泌代謝疾病。越來越多的研究表明，AD與T2DM有關，二者常并存并同時發展，而胰島素信號受損也是AD進展的一個關鍵危險因素。AD與T2DM還存在某些相似的病理特征，包括胰島素抵抗、淀粉樣變、糖皮質激素失衡、炎癥、線粒體功能障礙和氧化應激等。因此，使用治療糖尿病的藥物改善腦部糖代謝紊亂和胰島素抵抗來早期防治AD成為可能。

人胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是內源性腸促胰島素肽類激素，是治療T2DM的重要靶點。GLP-1及其類似物能通過血腦屏障參與大腦的生理活動和神經形成，其靶點GLP-1受體在中樞神經系統的整個大腦皮質和下丘腦均有表達。這些為GLP-1類似物治療中樞神經系統病變提供了有利條件。利拉魯肽注射液[商品名為諾和力(Victoza)]是一種新型的抗糖尿病藥物，在臨床中作為GLP-1類似物治療T2DM。研究表明，利拉魯肽能改善快速老化SAMP8小鼠和腦室注射Aβ誘導的AD小鼠的學習記憶功能狀態。目前常見的AD動物模型主要有雙轉基因模型和一些散發性模型，轉基因AD模型是在遺傳學的基礎上建立的，而腦室注射脲鏈佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的AD大鼠模型是一種與腦葡萄糖代謝相關的散發性模型，這與我們研究抗糖尿病藥物利拉魯肽對AD的治療效應關系更為密切。因而，本實驗中我們選擇以側腦室注射STZ誘導的AD大鼠為研究對象，對利拉魯肽對大鼠認知功能障礙是否有改善效應進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠24只，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號SCXK(吉)-2018-0007，體質量(200±20)g。實驗動物飼養在干凈的環境動物房，采用顆粒型普通大鼠飼養料喂養，飲用消毒自來水，自由進食和飲水。保持室內溫度為20～25℃，相對濕度為40%～60%，無噪音干擾，光照周期12 h晝夜循環。

1.2 主要試劑與儀器

利拉魯肽注射液購自諾和諾德(中國)制藥有限公司(批號HP50407)。利拉魯肽注射液為3 mL溶液中含18 mg利拉魯肽的預填充筆，臨用前配制。STZ購自北京索萊寶科技有限公司(批號601P021)。STZ注射前置于-20℃冰箱中凍存，避光干燥，現配現用，在30 min內注射完。磷酸化Tau Ser396多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司。大鼠腦立體定位儀，安徽正華生物儀器設備有限公司。Morris水迷宮分析系統，成都泰盟公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

Wistar大鼠隨機分為4組，分別為空白對照組、假手術組、模型組和治療組，每組6只。空白對照組不作任何處理；假手術組右側腦室注射生理鹽水14 d后皮下注射生理鹽水；模型組右側腦室注射STZ 14 d后皮下注射生理鹽水；治療組右側腦室注射STZ 14 d后皮下注射利拉魯肽干預治療。

1.3.2 側腦室注射

術前10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，劑量為4 mL/kg。待麻醉藥起效后，將大鼠固定在腦立體定位儀上，頭頂部去毛，碘伏消毒備皮區，正中矢狀切口，分離骨膜。參考文獻[7]，坐標為前囟后0.8 mm、矢狀縫旁開1.5 mm、深度3.6 mm。牙科鉆自定位點鉆開顱骨，暴露硬腦膜，使用微量注射器將STZ溶液自定位點緩慢注入右側腦室約10 μL(3 mg/kg，假手術組注射等體積生理鹽水)。注射時間為5 min，注入后留針5 min，以保證溶液充分彌散，再緩慢退出。注射結束后，縫合傷口，碘伏消毒，紅霉素軟膏局部涂抹處理傷口預防感染，術后白熾燈照射保持體溫至蘇醒。

1.3.3 利拉魯肽干預

側腦室注射14 d后開始藥物干預實驗。治療組皮下注射利拉魯肽(300 μg/kg)，假手術組和模型組皮下注射等劑量生理鹽水，連續給予4周。實驗期間觀察大鼠一般健康狀態，每周定時記錄大鼠體質量。

1.3.4

Morris

水迷宮實驗檢測大鼠認知功能

Morris水迷宮實驗用來評價大鼠學習記憶能力以及空間認知能力。Morris水迷宮設備是直徑180 cm，深50 cm的圓柱形水槽。提前將平臺置于目標象限中心，往水池注水，使平臺在水下2 cm左右，打開加熱器加熱并使水溫保持在20℃左右。實驗前，先將大鼠放在水迷宮實驗室熟悉環境30 min。測試分為兩個階段。①定向航行階段。將大鼠頭朝向池壁放入水中，記錄大鼠找到水下平臺的時間。如果大鼠90 s內未找到平臺，將其引導至平臺并停留10 s。大鼠連續訓練4 d，每天訓練4次，每天第1次訓練從相同象限開始，依次經其他象限，訓練順序保持一致。每次訓練間隔時間為15～20 min。最后通過錄像系統記錄大鼠在90 s內的逃避潛伏期，超過90 s以90 s計算。②空間探索階段。最后一次訓練24 h后，撤除平臺，進行空間探索實驗，所有的測試條件與第一階段的測試條件保持一致。隨機抽取兩個象限，將大鼠頭朝向池壁放入水池，讓其自由游泳90 s，通過系統軟件記錄它在90 s內目標象限停留的時間及穿越平臺次數。

1.3.5 大鼠腦組織取材

行為學實驗結束后，每組隨機選取3只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，將大鼠固定在解剖板上，開胸暴露心臟，將針頭插入左心室，用剪刀在右心耳處剪開一個小口，用預冷的生理鹽水進行心臟灌注，心臟流出近乎透明的液體后將生理鹽水換成預冷的4%多聚甲醛繼續心臟灌注，直至大鼠整個身體僵硬后停止灌注，隨后斷頭，獲取包含海馬和大腦皮質的腦組織，經4%多聚甲醛溶液固定24 h，保存在4℃冰箱，用于后續免疫組化實驗。余下大鼠直接經頸椎脫臼后斷頭取腦，在冰上快速獲取海馬組織，立即置于液氮中，最后凍存于-80℃冰箱，用于后續Western blot實驗。

1.3.6 免疫組化法檢測磷酸化Tau蛋白表達

大鼠腦組織經石蠟固定、切片、脫蠟、水化，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復液高溫修復，滴加一抗[p-Tau(Ser396)抗體稀釋比例1∶100]，4℃孵育過夜；第2天PBS液沖洗后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹脂加蓋玻片封片。

1.3.7

Western blot檢測磷酸化Tau蛋白表達

每組大鼠各稱取約20 mg海馬組織研磨，充分勻漿后按海馬：裂解混合液=1 mg∶10 mL加入裂解混合液，冰上裂解約1.5 h，每20 min取出渦旋一次；低溫高速離心10 min(4℃、12 000 r/min)，取上清液分裝待測。在組織蛋白樣本管中按體積比=4∶1加入上樣緩沖液，混勻后在100℃沸水中水浴10 min。樣本蛋白經凝膠電泳分離后，將目的蛋白轉至PVDF膜。轉完膜后于5%脫脂牛奶中封閉2 h，洗膜后加入一抗[p-Tau(Ser396)抗體和β-actin抗體稀釋比例均為1∶1 000]，4℃冰箱孵育過夜。次日洗膜后加二抗(抗體稀釋比例1∶10 000)，于37℃恒溫箱中孵育80 min。洗膜后于蛋白印跡儀器中顯色拍照。分析蛋白條帶上各處理組p-Tau(Ser396)和β-actin蛋白的灰度值，p-Tau(Ser396)與β-actin蛋白灰度值之比即為p-Tau(Ser396)蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件分析，數據

x

ˉ±

s

表示。免疫組織化學結果采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度，結果比較采用單因素方差分析。Morris水迷宮定位航行實驗數據采用重復測量方差分析，其余組間數據比較采用單因素方差分析。以

P＜

0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體質量變化

以大鼠腦室內注射STZ或生理鹽水前記為第0周體質量，實驗期間每周定時記錄一次大鼠體質量。結果見表1，顯示各組大鼠術后一周內體質量均略有下降，但組間差異無統計學意義(

P

＞0.05)，手術大鼠體質量從第二周開始增加，但組間差異仍無統計學意義(

P＞

0.05)。以上結果提示，STZ和利拉魯肽對大鼠體質量的影響在短時間里未見明顯變化。

表1 實驗期間各組大鼠體質量變化(g，x±s)

2.2 利拉魯肽改善STZ誘導的AD大鼠空間記憶能力

Morris水迷宮實驗結果見圖1。可見第1天各組大鼠表現無明顯差異，均需引導至目標象限平臺。第2、3、4天重復測量分析顯示大鼠各組間逃逸潛伏期差異有統計學意義(

P＜

0.05)。與空白對照組相比，假手術組大鼠的逸潛伏期和穿越平臺次數均無明顯變化(

P＞

0.05)，提示假手術對大鼠空間學習記憶能力無明顯影響；與假手術組相比，模型組大鼠逃逸潛伏期和穿越平臺次數明顯增加(

P＜

0.05)，提示STZ誘導的模型鼠空間學習記憶能力出現障礙；與模型組相比，治療組大鼠逃逸潛伏期和穿越平臺次數明顯減少(

P＜

0.05)，提示利拉魯肽能改善STZ誘導的AD大鼠空間學習記憶障礙。利拉魯肽治療后，各組大鼠在目標象限停留的時間百分比和對應組比較均有上升或下降現象，但差異均無統計學意義(

P＞

0.05)。以上結果提示，利拉魯肽能改善STZ所誘導的AD大鼠空間學習記憶障礙。

圖1 各組大鼠空間學習記憶能力表現

2.3 利拉魯肽降低STZ誘導AD大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達

采用ImagePro Plus 6.0軟件分析免疫組化圖片的平均光密度，結果見圖2，顯示與假手術組相比，模型組大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達增加(

P＜

0.05)；與模型組相比，治療組大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達減少(

P＜

0.05)。Western blot實驗結果顯示：與假手術組相比，模型組大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達增加(

P

＜0.05)；與模型組相比，治療組大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達減少(

P

＜0.05)。

圖2 利拉魯肽降低AD大鼠海馬區Tau蛋白Ser396位點磷酸化表達

3 討論

AD是一種多因素導致的進行性神經退行性疾病，危險因素包括年齡、遺傳、外傷性腦損傷、過量鋁暴露、飲食習慣等。除遺傳因素導致的家族性AD外，其余AD都可歸為散發性AD。在20世紀90年代前期，編碼β-淀粉樣前體蛋白和早老素(presenilins，PS1/PS2)的3種基因的突變被確定為家族性AD的病因。1995年發表了轉基因小鼠胞外Aβ沉積、神經性斑塊、突觸喪失及星形細胞和小膠質細胞增生的報道。從那時起，臨床前AD研究一直被轉基因小鼠模型所主導，此模型模擬了AD的神經病理學，并表現出類似AD的行為癥狀。然而，不到5%的家族性AD病例中也僅有5%的家族性AD患者在其中一個AD基因或載脂蛋白E因子等位基因ε4中攜帶致病突變，大多數家族性AD的病因仍未得到解釋。使用轉基因小鼠模型對AD候選藥物進行測試，發現許多藥物在改善模型認知缺陷和神經病理上皆有明顯效果，但這些藥物沒有被成功轉化為對人類患者的治療。其中一個主要原因可能是評價抗AD藥物動物模型的局限性，散發性AD與家族性AD的差異可能導致了較高的失敗率。

雖然轉基因模型仍是目前AD研究的主流，但人們也在尋找替代模型，其中側腦室注射糖尿病性毒素STZ模型近年來得到了廣泛應用。大腦葡萄糖代謝紊亂是AD的病理生理特征，轉基因模型與側腦室注射STZ模型之間的主要概念差異涉及腦葡萄糖低代謝在AD神經病理學因果關系鏈中的位置。淀粉樣蛋白級聯假說認為，Aβ是AD發生的關鍵環節，是引發AD病程的上游分子，而腦葡萄糖代謝低下是神經退行性變化過程的終點，或在任何情況下都是次要效應。但有研究人員觀察到，在有AD發病高風險的個體中，大腦葡萄糖代謝減少發生在臨床癥狀出現的幾年甚至幾十年之前。比如，早發性家族性AD家族的

PS1

基因突變攜帶者在估計的發病年齡前13年就表現出明顯的腦葡萄糖代謝減少。因此，有人提出認為腦代謝葡萄糖的能力降低是神經變性開始的中心點，之后才是淀粉樣蛋白沉積和神經纖維纏結的發展。

因此，本研究中我們選擇了與腦葡萄糖代謝相關的側腦室注射STZ誘導AD模型大鼠為研究對象，單次或雙次側腦室注射STZ可長期降低腦葡萄糖攝取，能產生多種類似于AD的分子、病理和行為特征效應，如認知功能損傷、細胞丟失、膠質細胞增生、Tau蛋白磷酸化水平增加和Aβ異常沉積等。本研究結果顯示，本假手術組相比，模型組大鼠逃逸潛伏期和穿越平臺次數均明顯增加，提示STZ誘導的AD模型大鼠存在認知功能損傷；免疫組化結果也顯示，模型組大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達增加。本研究中STZ誘導的AD模型大鼠產生了類似于AD的分子、病理和行為特征效應。利拉魯肽治療后，治療組的認知功能損傷得到改善，大鼠海馬p-Tau(Ser396)的表達也相對模型組減少。這與Li等研究GLP-1/GIP類似物DA5-CH對側腦室注射STZ所致AD大鼠作用效應的結果相同。但有研究顯示，STZ誘導的大鼠模型的認知障礙出現時間、葡萄糖攝取、乙酰膽堿轉移酶、冬胱甘肽水平和星形膠質細胞參數標志物均與性別有關，雌性大鼠對側腦室注射STZ損傷具有較高抗性。故本研究中均選取雄性大鼠進行實驗，但這與AD女性易感性較高相反。由于側腦室注射STZ模型與人類AD易感性存在的性別偏差，使側腦室注射STZ模型作為AD動物模型研究治療AD藥物存在一定缺陷。

綜上所述，STZ能誘導大鼠的認知功能損傷，并增加海馬p-Tau(Ser396)的表達，利拉魯肽能改善STZ誘導AD大鼠的認知功能損傷并降低海馬p-Tau(Ser396)的表達。提示使用以利拉魯肽為代表的治療糖尿病病人的新型抗糖尿病藥物來早期防治AD成為可能，為進一步推動GLP-1類似物用于AD的臨床治療提供了研究基礎。