miR-141-3p對腰椎間盤突出癥大鼠髓核組織核轉錄因子κB信號通路的影響*

陳勝樂， 米盼盼**， 許雅芳， 史學雙， 樊國峰， 王一鳳， 賈俊玲

(1.河北中石油中心醫院 骨科， 河北 廊坊 065000； 2.河北中石油中心醫院 影像科， 河北 廊坊 065000； 3.河北中石油中心醫院 病案科， 河北 廊坊 065000)

健康人群中腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)的高發年齡為30～40歲，50歲以后發病率可達90%[1]。LDH的主要臨床表現為復發性腰腿痛，伴有患肢麻木和肌無力，男性偶爾伴有腹股溝或睪丸疼痛，嚴重者壓迫馬尾神經，引起下肢麻木、肛周疼痛、會陰麻木及括約肌麻痹等癥狀[2]。目前臨床上對LDH的發病機制尚未完全了解，但有學者支持的LDH病因病機主要有機械壓迫理論、炎癥反應理論、自身免疫理論和生物力學改變理論[3]。核轉錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是一種廣泛存在于細胞質中的核轉錄因子，在細胞刺激后的信號通路中發揮作用，它通過調節趨化因子、黏附分子、生長因子和多種酶的基因表達，在炎癥反應、免疫調節和細胞凋亡中發揮重要作用[4-5]。近年來，通過動物實驗觀察椎間盤退變模型和人椎間盤退變髓核細胞，發現退變髓核細胞中NF-κB的陽性表達率較高，因此NF-κB信號通路通常被認為與LDH有關[6]。miRNA是不編碼蛋白質的單鏈RNA，miR-141-3p基因位于14號染色體，參與腫瘤的發生，其在不同腫瘤組織中的表達水平也不同[7-8]。有學者發現miR-141-3p參與調節腫瘤細胞的生長，對不同的腫瘤細胞有不同的作用[9]，miR-141-3p還可通過靶向作用于腫瘤壞死因子受體相關因子5(tumor necrosis factor receptor-associated factor-5，TRAF5)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF6)而對NF-κB的激活產生抑制作用，進而抑制前列腺癌細胞的侵襲和轉移，提示miR-141-3p與NF-κB信號通路活化存在一定的關系[10]。本研究自體髓核回植法成功制備LDH大鼠模型，麻醉后取出大鼠髓核組織細胞培養，觀察miR-141-3p對髓核組織細胞的調控作用，探討NF-κB信號通路與LDH的相關性和miR-141-3p對LDH模型大鼠NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 選取20只8周齡雄性SD大鼠，清潔級、3月齡、體質量(198.68±7.55)g，由湖南省中醫藥研究院動物實驗室購入，合格證號為SCXK(湘)2021-0318，自體髓核回植法[11]成功建立腰椎間盤突出大鼠模型18只。

1.1.2試劑與儀器 胎牛血清和RPMI 1640培養基(南京生航生物技術有限公司)，Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(Invitrogen)，miR-141-3p mimics及其對照(廣州市銳博生物科技有限公司)，Trizol試劑及逆轉錄試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍試劑(MTT,美國Amresco)，蛋白提取和檢測試劑(上海碧云天生物技術有限公司)，NF-κB信號通路相關抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；日立投射電子顯微鏡(型號H-7650，上海筑金分析儀器有限公司)，離心機(型號BT-1500，丹東百特儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1模型制備[11]腹腔注射10%水合氯醛后，大鼠俯臥位固定，常規準備背部和尾部手術區域，進行備皮和消毒，先切開兩個尾盤，開放的椎間盤應包含上下軟骨終板，刺破椎間盤上下板暴露髓核，用7號手術線將椎間盤包裹成“米”形待用；依次切開皮膚組織，使L5/L6椎間隙和L5神經根暴露，將準備好的橈側椎間盤置入左側L5神經根，并縫合。術后3 d內每日腹腔注射青霉素[80萬U/(kg·d)]。造模第3天，采用Siegal神經功能六級評分法[12]評定大鼠神經功能，評分>2級(>6分)為建模成功。

1.2.2分組及轉染 將18只大鼠處死后取出髓核組織分為miR-141-3p mimics轉染組、轉染miR-141-3p陰性對照組及不進行轉染正常對照組，每組6例；轉染組大鼠體質量(201.68±6.49)g，陰性對照組大鼠體質量(197.72±3.56)g，正常對照組大鼠體質量(199.36±5.94)g。麻醉后處死大鼠，在解剖顯微鏡下用眼科手術器械去除大鼠背部皮膚和軟組織，取出椎間盤，去除環纖維和軟骨板，將提取的髓核組織置于含DMEM(0.1%小牛血清)1 mL的12孔板，37 ℃、5%CO2培養箱培養。細胞貼壁后，每1～2 d更換1次培養基，當細胞融合度>85%時，加入胰蛋白酶消化傳代，將對數型髓核細胞接種于6孔板上，37 ℃培養箱中培養。當細胞融合率達到50%時，加入無血清培養基同步處理12 h，按說明書進行Lipofectamine 2000試劑轉染。轉染后，細胞均置于37℃培養箱中培養，6 h后換用正常培養基，共培養48 h。

1.3 觀察指標

1.3.1細胞活力 采用MTT法測定，各組細胞均培養48 h，于每孔內均加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h， 加入DMSO 150 μL，搖動10 min，然后將樣品置于酶標儀上，490 nm處檢測吸光度值，計算細胞活性，細胞活性(%)=轉染組或陰性對照組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

1.3.2細胞侵襲能力 細胞濃度調整為2×107個/L，將細胞懸液接種于包被或不包被Matrigel膠的Transwell上室中，培養液添加到下室；培養24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察5個隨機視野內結晶紫染色細胞數為細胞浸潤數。

1.3.3細胞凋亡率 采用流式細胞儀檢測，將5×105對數生長的髓核細胞接種于培養瓶內，收集懸浮和貼壁細胞，在Annexin V-FITC488和PI溶液中室溫避光孵育15 min，測定3次計算平均值。

1.3.4炎性指標 培養48 h后，以ELISA法檢測髓核細胞中白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應蛋白(C-reactiveprotein，CRP)水平。將抗原使用包被稀釋液稀釋至適當濃度，每孔加入抗原100 μL，置于37 ℃下反應4 h，棄孔中液體；將5%小牛血清置于37 ℃下封閉40 min，結束后使用洗滌液洗滌3次、3 min/次；將1 ∶50稀釋的樣品加入酶標反應孔內，確保每個樣本雙孔，100 μL /孔，置于37 ℃下反應60 min，洗滌液洗滌3 min；加入酶標抗體，置于37 ℃下反應60 min，加洗滌液洗滌；加入底物液，置于37 ℃下避光放置5 min，加入終止液，加入顯色劑50 μL，震蕩均勻后于37 ℃下避光顯色15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應； 15 min后測定450 nm波長時各孔的吸光度值。

1.3.5NF-κB信號通路相關蛋白水平 采用Western blot法檢測，提取髓核細胞總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白質濃度，對等量蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，密封于5%脫脂奶粉中，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)洗滌3次，加入核因子κB磷酸化65(nuclear factor kappa-B phosphorylation 65，NF-κB p65，1 ∶800)、IκB激酶α(IκB kinase-α，IKK-α)、磷酸化IκB激酶α(phosphorylation IκB kinase-α，p-IKK-α)、IκB激酶α抗體(IκB-kinase α antibody，IKB-α)、磷酸化IκB激酶α抗體(phosphorylation IκB-kinase α antibody，p-IKB-α，1 ∶1 000)相應的一抗，在4 ℃培養過夜。PBST洗滌3次，加入二抗(1 ∶3 000)，室溫下孵育2 h，PBST洗滌3次，加入電化學發光試劑，以β-actin作為內參，暗室內凝膠成像系統拍照，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.6NF-κB信號通路相關mRNA水平 采用熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative reverse，qRT-PCR)檢測，從培養48 h的髓核細胞中提取RNA，并測定純度和濃度，逆轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒的說明進行PCR。NF-κBp65的上游引物為AGCGTAGCTTATCAGACTGATG，下游引物為TAGCTTATCAGACTGATGTTGA；IKK-α的上游引物為CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT，下游引物為CAGTGCAATGATGAAAGGGCAC；IKB-α的上游引物為GTCGTATCCAGTGCAGGGTGAC，下游引物為CGCAGGGTCCGAGGTATTCTCG。95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環，60 ℃最后延長5 min，產物200 bp，以β-actin為內標，用2-△△Ct法計算相對表達。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 細胞活力、侵襲及凋亡率比較

培養48 h時，轉染組髓核組織的細胞活力、細胞侵襲個數低于陰性對照組和正常對照組，凋亡率高于陰性對照組和正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1～3。

表1 各組髓核組織培養48 h時細胞活力、侵襲及凋亡率Tab.1 Cell viability, invasion, and apoptosis of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each

注：A為轉染組，B為陰性對照組，C為正常對照組。圖1 各組髓核組織培養48 h時細胞活力Fig.1 Cell viability of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

2.2 髓核組織IL-1、IL-10、TNF-α、ESR及CRP表達

結果顯示，3組髓核組織培養48 h時的IL-1、TNF-α、ESR、CRP水平比較，轉染組<陰性對照組<正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)； IL-10水平比較，轉染組>正常對照組>陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組髓核組織培養48 h時IL-1、IL-10、TNF-α、ESR及CRP水平Tab.2 Comparison of IL-1,IL-10,TNF-α,ESR, and CRP levels of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

2.3 NF-κB信號通路相關因子水平

結果顯示，培養48 h時，轉染組NF-κB p65、IKK-α、p-IKK-α、IKB-α及p-IKB-α水平低于陰性對照組和正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4和表3。

表3 各組髓核組織培養48 h時NF-κB信號通路相關因子水平Tab.3 The levels of NF-κB signaling pathway related factors in nucleus pulposus tissue culture for 48 h in each group

圖4 各組髓核組織培養48 h時NF-κB信號通路相關因子水平(Western blot)Fig.4 The levels of NF-κB signaling pathway related factors in nucleus pulposus tissues cultured for 48 h in each group (Western blot)

2.4 NF-κB信號通路相關因子mRNA水平

結果顯示，培養48 h時，轉染組NF-κBp65、IKK-α及IKB-αmRNA水平低于陰性對照組和正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組髓核組織培養48 h時NF-κB信號通路相關因子mRNA水平比較Tab.4 Comparison of mRNA levels of NF-κB signaling pathway related factors cultured for 48 h in each group

轉染組 陰性對照組 正常對照組圖2 各組髓核組織培養48 h時侵襲細胞個數(結晶紫染色，×200)Fig.2 Number of invasive cells in each group of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h (crystal violet staining, ×200)

轉染組 陰性對照組 正常對照組圖3 各組髓核組織培養48 h時細胞凋亡率Fig.3 Apoptosis of nucleus pulposus tissue cultured for 48 h in each group

3 討論

臨床中已經明確椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病發生的前提和基本病理過程，椎間盤退變是由細胞生物學、機械應力、營養、免疫和年齡的變化引起的，相關的臨床癥狀包括LDH、頸椎和腰椎神經根病、頸脊髓病和椎間盤源性腰痛，可導致脊柱損傷甚至殘疾，影響正常生活和工作，但其確切發生機制尚不清楚[13-14]。NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的多向轉錄因子，最早從成熟的B淋巴細胞中提取，可與IgK輕鏈基因結合，以多種方式在細胞增殖、分化和凋亡中發揮關鍵作用[15]。NF-κB的異常激活增強了其轉錄活性，進而觸發細胞間信號級聯，導致一系列疾病[16]。近年來的研究表明，NF-κB信號通路在椎間盤退變中起重要作用，抑制NF-κB信號通路可延緩椎間盤退變過程[17]，但NF-κB信號通路的激活途徑尚不清楚。

miRNA的長度約為15～25 bp，在人體組織中廣泛表達，參與了幾乎所有的生理過程，如胚胎發育和組織功能維持[18]。miRNA還參與心血管疾病、腫瘤和其他病理過程的調控，是一種與細胞生長和凋亡密切相關的調節因子，參與調節神經細胞和其他細胞的正常生理功能，在腫瘤組織中異常表達，可以作為腫瘤促進劑或抑癌劑來調節腫瘤細胞的生長[19-20]。目前miR-141-3p在乳腺癌及其他腫瘤組織中已被發現過表達， miR-141-3p可能是一種抑癌基因，在腫瘤細胞的生長和凋亡中起重要作用，如miR-141-3p可抑制胃癌及其他腫瘤細胞的生長，促進前列腺癌及其他腫瘤細胞的生長[21-22]。因此本研究分析了miR-141-3p對LDH模型大鼠NF-κB信號通路的影響，以為今后臨床治療提供參考。

本研究結果顯示，培養48 h后轉染組髓核組織的細胞活力、侵襲個數均低于陰性對照組和正常對照組，凋亡率高于陰性對照組和正常對照組，IL-1、TNF-α、ESR、CRP水平均低于陰性對照組和正常對照組，IL-10水平高于陰性對照組和正常對照組，且正常對照組高于陰性對照組，NF-κB p65、IKK-α、p-IKK-α、IKB-α、p-IKB-α蛋白及其mRNA水平均低于陰性對照組和正常對照組，說明miR-141-3p高表達能夠抑制NF-κB信號通路的激活，抑制髓核細胞活力和侵襲，促進細胞凋亡，緩解炎癥反應。這是由于正常狀態下激活NF-κB信號通路可誘導炎癥因子的表達，誘導腰椎間盤髓核細胞發生炎癥反應，促進腰椎間盤退變，誘導LDH，直接刺激周圍神經組織，產生癥狀[23]。且NF-κB信號通路激活后，NF-κB可誘導腰椎間盤髓核細胞大量凋亡，導致髓外基質的合成，最終導致LDH的退行性病變，導致LDH[24-25]。因此本研究中miR-141-3p在髓核細胞中的過表達抑制了NF-κB p65、IKK-α和p-IKK-α等的表達，提示miR-141-3p可抑制NF-κB信號通路激活，聯系到臨床中已明確NF-κB在腫瘤細胞增殖和侵襲中的作用，推測miR-141-3p在髓核細胞中的抗增殖和侵襲作用可能與抑制NF-κB信號通路相關，但具體的調控機制有待進一步探討。

綜上所述，miR-141-3p高表達能夠對NF-κB信號通路的激活產生抑制作用，進而抑制髓核細胞活力和侵襲，促進細胞凋亡，緩解炎癥反應。