蔓荊子藥材與炒蔓荊子指紋圖譜對(duì)比研究

瞿昊宇，陳光宇，佘義勇，何 群，謝夢(mèng)洲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

蔓荊子為辛涼解表常用中藥，以“蔓荊實(shí)”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]，為馬鞭草科植物蔓荊VitextrifoliaL.或單葉蔓荊VitextrifoliaL.var.simplicifoliacham的干燥成熟果實(shí)。主要產(chǎn)于江西、山東、福建、廣西、廣東、浙江、安徽等地，分布廣、產(chǎn)量大，其道地藥材產(chǎn)區(qū)為山東(道地藥材是指具有特定產(chǎn)區(qū)，貨真質(zhì)優(yōu)的中藥材)，味辛、苦，微寒，歸膀胱、肝、胃經(jīng)。具有疏散風(fēng)熱、清利頭目之功效，用于風(fēng)熱感冒頭疼、齒齦腫痛、目赤多淚、目暗不明、頭暈?zāi)垦！闅v版中國(guó)藥典收載，以炮制品(炒蔓荊子)入藥，炒蔓荊子多用于風(fēng)熱感冒頭痛類的中藥處方中。現(xiàn)代藥理研究表明，蔓荊子具鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抗菌、祛痰、抗腫瘤等作用[2-3]。蔓荊子主要含揮發(fā)油和黃酮類成分，揮發(fā)油主要有茨烯、蒎烯、α-菲蘭烯、香檜烯、B-蒎烯等；黃酮類成分是蔓荊子鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等藥理作用的主要藥效成分。以蔓荊子黃素為代表，還有紫花牡荊素、木樨草素、篙黃素索多甲氧基黃酮、木揮草索-7-葡萄糖酯、四輕基甲氧基黃酮等。一般認(rèn)為蔓荊子經(jīng)炒制后，其辛散之性較為緩和，質(zhì)變酥脆，利于粉碎和有效成分的煎出。前期對(duì)蔓荊子炒制工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，蔓荊子炒制后提高了有效成分的溶出，浸出物含量與蔓荊子黃素含量較生品均有所增加，其量值傳遞率高，表明優(yōu)選出來(lái)的炒蔓荊子炮制工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可靠、可行，但僅以浸出物含量與蔓荊子黃素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)不能全面反映蔓荊子炒制前后質(zhì)量屬性的改變，故為比較蔓荊子炒制前后化學(xué)成分的變化及質(zhì)量傳遞信息，評(píng)價(jià)炒蔓荊子的質(zhì)量屬性，本文通過(guò)研究蔓荊子炒制前后指紋圖譜的改變，為炒蔓荊子質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；包括G1316A四元梯度泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A恒溫箱、G1314A紫外檢測(cè)器、Agilent Chemstation 色譜工作站)；中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TCS-100型電子臺(tái)秤(上海乾峰電子儀器有限公司)；PW135型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；QY-1中藥切片機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；HWS-80B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市意博高科實(shí)驗(yàn)儀器廠)；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；LC-E096P灶頭(電陶爐，廣東順德忠臣電器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

28批蔓荊子原藥材經(jīng)王智教授鑒定為單葉蔓荊V.trifoliaL.var.simplicifoliaCham.的干燥成熟果實(shí)；炒蔓荊子(由本實(shí)驗(yàn)室自制)；蔓荊子黃素對(duì)照品(批號(hào)：111554-201705)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，供含量測(cè)定用(蔓荊子黃素含量98.3%)；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒蔓荊子炮制方法

取蔓荊子藥材，按2020版《中國(guó)藥典》一部363頁(yè)蔓荊子藥材項(xiàng)下檢查符合有關(guān)規(guī)定，無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變，有清香味，挑選除去雜草及碎石粒，20目篩篩選，風(fēng)選簸除去雜質(zhì)、灰屑及部分宿萼碎片，凈制處理，將炒藥鍋加熱使其升溫至100 ℃，取100 g前處理的蔓荊子藥材投入鍋中，炒制5 min，取出，晾涼，20目篩篩選，再風(fēng)選簸除去雜質(zhì)、灰屑及部分宿萼碎片。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[4-6]

液相色譜柱(月旭，Ultimate?XB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；洗脫方式：線性梯度，0～70 min(20%～80%甲醇)檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按蔓荊子黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.3 供試品溶液的制備

分別取28批各批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心7 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照供試品溶液的制備

取缺蔓荊子原藥材和炒蔓荊子樣品的甲醇溶劑，按“2.2”項(xiàng)同法制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.896%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定其HPLC譜圖，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.947%，表明本分析方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，測(cè)定其HPLC譜圖，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值基本一致，RSD=1.853%，表明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 指紋圖譜色譜峰的標(biāo)定[7-8]

取蔓荊子黃素約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，精密加入甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素1.07 mg的母液1；精密移取1 mL蔓荊子黃素母液1置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素0.107 mg的母液2；精密移取3 mL蔓荊子黃素母液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素32.1 μg的對(duì)照品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行高效液相色譜分析。照“2.1”項(xiàng)和“2.3”項(xiàng)下處理的蔓荊子藥材及炒蔓荊子供試品溶液，“2.4”項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液，“2.6”項(xiàng)下蔓荊子黃素對(duì)照品溶液的色譜見(jiàn)圖1-圖4。

圖1 陰性對(duì)照品(甲醇空白)

圖2 蔓荊子黃素對(duì)照品

圖3 蔓荊子原藥材供試品

圖4 炒蔓荊子供試品

2.7 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)(相似度的計(jì)算)

采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》，對(duì)28批單葉蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜進(jìn)行分析[7-9]，設(shè)定時(shí)間窗寬度0.1 min、多點(diǎn)校正、譜峰匹配，以MJZ-01及CMJZ-01色譜圖為藥材及炮制品的參照?qǐng)D譜，藥材及炮制品各15批不同來(lái)源蔓荊子指紋圖譜見(jiàn)圖5-圖6。由圖可知，每批蔓荊子原藥材或炒蔓荊子含有8個(gè)共有色譜峰，其中保留時(shí)間為66.0 min處的8號(hào)色譜峰為蔓荊子黃素對(duì)照品的色譜峰。

圖5 28批蔓荊子原藥材供試品

圖6 28批炒蔓荊子供試品

28批蔓荊子藥材和炒蔓荊子各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度計(jì)算結(jié)果，見(jiàn)表1。

對(duì)表1中28批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子指紋圖譜相似度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得配對(duì)樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.968 4，其均值差異檢驗(yàn)t=0.120 6，df=27，P=0.904 9，結(jié)果表明蔓荊子原藥材和炒蔓荊子指紋圖譜大體一致，蔓荊子炒制前后其化學(xué)成分變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜相似度分析結(jié)果

2.8 蔓荊子藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量分析與比較

15批符合2020版《中國(guó)藥典》蔓荊子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蔓荊子藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量結(jié)果，見(jiàn)表2。

對(duì)表2中15批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得配對(duì)樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.959 6，其均值差異檢驗(yàn)t=4.123 7，df=14，P=0.001 0，結(jié)果表明蔓荊子原藥材經(jīng)過(guò)炮制后所得的炒蔓荊子，其蔓荊子含量顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜相似度分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究建立了以《中國(guó)藥典》2020版蔓荊子含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液為原料液的指紋圖譜，與已報(bào)道的蔓荊子指紋圖譜研究中采用氯仿制備供試品溶液相比，所用溶劑僅為甲醇，溶劑毒性低，一步回流提取過(guò)濾即可，過(guò)程簡(jiǎn)單，結(jié)果重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，可作為《中國(guó)藥典》收載蔓荊子藥材及炮制品指紋圖譜項(xiàng)目提供參考。

由指紋圖譜可知，蔓荊子炒制前后指紋圖譜相似度基本未改變，說(shuō)明其化學(xué)成分炒制前后保持一致，質(zhì)量屬性保持一致。

由蔓荊子黃素含量可知，蔓荊子炒制后其蔓荊子黃素含量較生品均有所增加，說(shuō)明炮制可以除去蔓荊子藥材中的雜質(zhì)，保留藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。