HPLC測定梔黃消瘀止痛膏中大黃酚含量

魯明明，林新艷，鄔學(xué)群，莫 文，許金海，范趙翔，湯茹茹，殷書梅*

(1.江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210046；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

梔黃消瘀止痛膏是在我國著名武術(shù)傷科大師王子平的經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的橡膠膏劑，處方由大黃、梔子、乳香、地鱉蟲等六味中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。臨床用于跌打損傷初期、運(yùn)動后急性軟組織損傷、骨折腫痛劇烈屬氣滯血瘀證，證見以踝膝肘腕等關(guān)節(jié)腫痛為甚者，患者可在傷處出現(xiàn)青紫瘀斑或血腫，關(guān)節(jié)腫脹、活動受限等[1-2]。原制劑為軟膏，臨床采用藥粉和飴糖攪拌均勻后直接涂布貼敷，不適宜長期存放，且患者反饋清潔度不佳，攜帶不方便。本制劑對處方藥材進(jìn)行合理提取后選用適宜基質(zhì)形成橡膠膏劑，更符合臨床需要。方中以大黃作為君藥，其化學(xué)成分包含游離蒽醌衍生物、結(jié)合狀蒽醌衍生物以及番瀉葉苷A、B、C等，此外還含有鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類及植物甾醇等[3-4]。大黃臨床上具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效。本制劑選擇活性成分大黃酚作為制劑質(zhì)量控制指標(biāo)，并建立了一種測定梔黃消瘀止痛膏中大黃酚含量的色譜方法，可對指標(biāo)成分進(jìn)行定量控制從而確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定及有效。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過程報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器：Agilest 1200(四元泵，VWD檢測器)；Mettler AG135電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十萬分之一)；Mettler AB135S電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十萬分之一)；恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司，型號HH-2)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號KQ-500DE)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國艾卡，型號IKA RV10)。試劑：甲醇-分析純(南京化學(xué)試劑200106022H)；乙醇(南京化學(xué)試劑200211160H)；氯仿(南京化學(xué)試劑20115126D)；鹽酸(南京化學(xué)試劑170811285H)；磷酸(南京化學(xué)試劑170310536D)；純凈水。對照品：大黃酚對照品(批號110796-201922，純度99.4%，供含量測定，中國食品藥品檢定研究院)。樣品：梔黃消瘀止痛膏(批號：200501、200502、200503，江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照《中國藥典》[5]2015年版一部“大黃藥材含量測定”項(xiàng)下總蒽醌含量測定方法，對高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選定的色譜條件為：色譜柱島津Wondasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為35 ℃，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，理論塔板數(shù)不低于3 000。色譜見圖1、圖2。

圖1 對照品大黃酚色譜

圖2 供試品溶液色譜

2.2 供試品制備方法

取貼膏2片，蓋襯除去后將藥膏刮下，混勻，取0.5 g，精密稱定后置入具塞錐形瓶內(nèi)，加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，減失的重量以甲醇補(bǔ)足，搖勻，濾過。精密移取提取液5 mL置入燒瓶中，將乙醇揮去，加入10 mL鹽酸溶液(8%)，超聲2 min，加入三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，取出，待冷后置入分液漏斗，燒瓶用適量三氯甲烷進(jìn)行洗滌，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分取三氯甲烷層，剩余酸液再用三氯甲烷提取3次，10 mL/次，合并三氯甲烷液，減壓回收，殘?jiān)约状既芙舛ㄈ葜?0 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取大黃酚對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，搖勻，配制成每1 mL含16.27 mg的儲備液。精密吸取儲備液，用甲醇作溶劑，配制成濃度為4.068、8.135、16.27、32.54、65.08 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下(色譜柱為Wondasil，柱號為7H9701-21)，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)2次，測定峰面積。以進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸計(jì)算，即得大黃酚的線性回歸方程為：Y=44.098X+0.567 9，相關(guān)系數(shù)R2= 1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大黃酚在4.068～65.08 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性，結(jié)果見表1。

表1 大黃酚的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取含大黃酚濃度為16.27 μg/mL的對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測定峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%，儀器精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品1 g，精密稱定，平行6份，制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得出6份樣品中大黃酚含量測定結(jié)果的RSD值為1.1%，顯示重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液一份，分別在0、2、4、8、12、24 h依次注入高效液相色譜儀，記錄大黃酚的峰面積，計(jì)算測定結(jié)果的RSD值為1.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(大黃酚含量1.66 mg/g)約1 g，平行9份，精密稱定。上述樣品每3份分為1組，每組分別按含大黃酚含量的0.5倍、1.0倍、1.5倍準(zhǔn)確加入大黃酚對照品溶液，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，并記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大黃酚的加樣回收率結(jié)果良好，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測定

分別取3批中試梔黃消瘀止痛膏(批號：200501、200502、200503)各約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算制劑中大黃酚的含量，結(jié)果見表6。

表6 三批梔黃消瘀止痛膏中大黃酚的含量

3 討論

流速考察：在流速分別為0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min，其余色譜條件不變，對供試品溶液進(jìn)樣考察，結(jié)果表明，供試品溶液中的大黃酚色譜峰在上述三種流速下均能較好分離，說明不同流速條件下的耐用性較好；柱溫考察：在柱溫分別為30 ℃、35 ℃和40 ℃，其余色譜條件不變，對供試品溶液進(jìn)樣考察，結(jié)果表明，供試品溶液中的大黃酚色譜峰在上述三種柱溫下的分離度無影響，說明不同溫度的耐用性較好；色譜柱考察：在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，選用不同品牌的色譜柱(Kromasil 100-5 C18、Epic C185u、Wondasil C18)，對供試品溶液進(jìn)樣考察，結(jié)果表明，分離度、理論塔板數(shù)均能夠滿足要求，說明耐用性較好；在大黃酚的含量測定中，分別考察了流動相甲醇-0.1%磷酸的比例95∶5、90∶10、85∶15及80∶20，分別進(jìn)樣分析，甲醇-0.1%磷酸(80∶20)流動相進(jìn)樣分析的色譜圖中大黃酚的峰可以達(dá)到很好分離，且峰型較好。故選擇確定流動相為甲醇-0.1%磷酸(80∶20)。檢測波長選擇：在紫外分光光度計(jì)下對大黃酚對照品溶液進(jìn)行掃描，大黃酚最大吸收波長在220～230 nm區(qū)間內(nèi)有最大吸收，但樣品供試品溶液成分復(fù)雜，為避免其他物質(zhì)影響，最終選擇2015版藥典“大黃”項(xiàng)下總蒽醌含量測定的波長254 nm，作為本方法的檢測波長。

《本草新編》記載大黃性甚速，走而不守，善蕩滌積滯、調(diào)中化食、通利水谷、推陳致新、導(dǎo)瘀血、破癥結(jié)、散堅(jiān)聚、止疼痛、敗癰疽熱毒、消腫脹，俱各如神。《日華子本草》提及大黃可“調(diào)血脈，利關(guān)節(jié)，泄塑滯”，外敷用于各類瘡癤癰毒。歷代醫(yī)家以及《神農(nóng)本草經(jīng)》《綱目》《藥性論》等對大黃的應(yīng)用均有詳細(xì)闡述：①積滯便秘；②血熱吐衄，目赤咽腫：本品性味苦寒能降，可下泄上炎之火，具清熱瀉火、涼血止血之功；③跌撲損傷、熱毒瘡瘍及水火燙傷；④瘀血證：下瘀血，清瘀熱，能活血逐瘀通經(jīng)，為臨床骨傷科常用藥物；⑤濕熱證、淋證。文獻(xiàn)報(bào)道大黃蒽醌類成分有較強(qiáng)的抑制PGE2及抑制MAPK級聯(lián)系統(tǒng)的作用，表明大黃可通過抑制PGE2生成而產(chǎn)生抗炎作用[6]。另有報(bào)道，大黃外用具有顯著的消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用。本試驗(yàn)采用HPLC法對制劑中大黃酚成分開展了方法學(xué)考察，建立了適宜的色譜方法，通過三批中試樣品進(jìn)一步驗(yàn)證了大黃酚含量測定的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)樣品200501-200503批次因使用的是同一批中間體生產(chǎn)，本品大黃酚含量為1.62 mg/g，考慮到轉(zhuǎn)移率等問題，建議將含量初定為1.50 mg/g。后期跟進(jìn)積累3～5批大黃原料所生產(chǎn)成品大黃酚含量，再確定具體值。同時對大黃原料及中間體分別建立內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。