基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)的化濕敗毒顆粒治療新型冠狀病毒肺炎作用機制及活性成分篩選研究

王恩龍，何黎黎，李 婧，2*

(1.西南民族大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點實驗室，四川成都 610041)

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所引起的一種急性感染性肺炎[1]，輕癥患者或初期患者主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，包括咳嗽、發(fā)熱、氣促以及呼吸困難等；后期或重癥患者可導(dǎo)致肺炎、急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[2]。然而，目前針對COVID-19尚無特效的化學(xué)藥物[3]，因此，從中藥中篩選針對抗COVID-19的中藥復(fù)方及活性化合物十分迫切。

化濕敗毒顆粒是國家藥品監(jiān)督管理局批復(fù)的首個治療新冠肺炎的中藥臨床批件，也是由此次疫病理論和臨床結(jié)合創(chuàng)新所得。本方由14味中藥組成，包括生麻黃、生石膏、杏仁、赤芍、葶藶子、法半夏、甘草、茯苓、藿香、草果、蒼術(shù)、厚樸、生黃芪、生大黃。中國醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所、中國中醫(yī)科學(xué)院實驗研究表明，化濕敗毒顆粒在動物及臨床應(yīng)用中均顯示出良好效果。然而化濕敗毒顆粒藥味多、成分復(fù)雜，抗COVID-19作用關(guān)鍵活性成分及作用機制尚不清楚。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從整體上預(yù)測藥物作用靶點并分析作用機制的方法[4]，是目前生物信息學(xué)研究中藥的常用方法，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究化濕敗毒顆粒抗COVID-19作用機制與中藥多成分多靶點的研究思路相符。分子對接技術(shù)是目前一種廣泛應(yīng)用的能快速準(zhǔn)確地預(yù)測蛋白-配體復(fù)合物結(jié)合構(gòu)象和親和力并輔助篩選活性成分的重要研究技術(shù)[5]。近期，SARS-CoV-2的主要靶蛋白3CL水解酶蛋白(3CLpro)、宿主細胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)及RNA 依賴性RNA聚合酶(RdRp)相繼被解析，為分子對接篩選抗COVID-19活性中藥成分提供了基礎(chǔ)[6]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)，預(yù)測化濕敗毒顆粒治療COVID-19作用機理，篩選其潛在活性成分，以期為后續(xù)實驗研究開發(fā)以及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 化濕敗毒顆粒活性成分及作用靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫挖掘化濕敗毒顆粒中14種藥材的化學(xué)成分。以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%以及藥物相似性(Drug-likeness，DL)≥0.18為參考評估篩選候選化合物，建立“化濕敗毒顆粒活性成分數(shù)據(jù)庫”。通過TCMSP檢索以上活性成分的潛在作用靶點并整合，映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)統(tǒng)一為基因名，建立“化合物靶點數(shù)據(jù)庫”。

1.2 疾病相關(guān)靶點的篩選

在OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/) 中檢索與病毒及肺炎相關(guān)的基因，將2種方法得到的靶蛋白整合并與“1.1”中得到的化合物靶點采用R語言取交集，作為化濕敗毒顆粒潛在的作用靶蛋白。

1.3 化濕敗毒顆粒成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

Cytoscape是一款能直觀分析藥物治療疾病的作用機制的可視化軟件[7]。將化濕敗毒顆粒的潛在活性成分及作用靶點通過Cytoscape(Version 3.7.1)建立“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(node)表示化合物及靶點，節(jié)點之間的互作用關(guān)系由邊(edge) 表示。節(jié)點的重要性可以通過自由度(Degree)及介數(shù)(Betweenness centrality)來評估。節(jié)點的Degree表示與節(jié)點連接的邊的數(shù)量，Degree越大的節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。使用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)。

1.4 生物過程(GO)與通路分析(KEGG)

生物學(xué)信息注釋(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫可以進行基因或蛋白顯著富集的生物學(xué)注釋。將化濕敗毒顆粒潛在的作用靶基因ID導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對化濕敗毒顆粒作用靶基因可能存在的生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)及分子功能(Molecular function，MF)進行生物過程GO富集分析(P<0.05)以及KEGG通路富集分析(P<0.05)，根據(jù)P值大小繪制氣泡圖及柱狀圖。

1.5 分子對接分析關(guān)鍵活性成分

從RSCB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中下載SARS-CoV-2的3CLpro(PDB ID：6LU7)、ACE2(PDB ID：1R42)及RdRp(PDB ID：6M71)蛋白三維結(jié)構(gòu)用于分子對接研究。采用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件刪除受體蛋白復(fù)合物中水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件。從Pubchem下載“1.3”項中Degree較高的小分子化合物3D坐標(biāo)文件進行預(yù)處理后保存為pdbqt格式，作為對接配體。分別以3CLpro、ACE2及RdRp蛋白為受體，將小分子化合物作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)或文獻報讀的活性位點確定分子對接的位置，根據(jù)每個受體蛋白活性口袋設(shè)置Gridbox坐標(biāo)及大小，采用Auto Dock Vina進行分子對接，對對接結(jié)果進行分析處理，篩選化濕敗毒顆粒潛在活性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 化濕敗毒顆粒活性成分篩選及靶點獲取

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到的化濕敗毒顆粒活性成分共186個，其中生麻黃18個、杏仁12個、赤芍21個、葶藶子7個、甘草48個、法半夏10個、茯苓14個、草果2個、藿香11個、蒼術(shù)8個、生黃芪18個、厚樸2個、生大黃15個。化濕敗毒顆粒中部分活性成分信息見表1。

表1 化濕敗毒顆粒中部分活性成分信息

2.2 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點預(yù)測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“2.1”項中篩選得到的186種化合物的作用靶點，去除重復(fù)靶點后與在OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到的與疾病相關(guān)的基因取交集，得到化濕敗毒顆粒潛在作用靶蛋白共237個。

2.3 化濕敗毒顆粒“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將化濕敗毒顆粒活性成分及作用靶點的信息導(dǎo)入到Cytoscape軟件建立“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。由圖1可見，“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)中有123個化合物及相應(yīng)的靶點237個，共包含360個節(jié)點及2 808條邊。拓撲分析顯示化合物的平均Degree為7.8，說明每個活性成分可作用于多個靶點，化濕敗毒顆粒作用具有多成分、多靶點特性。節(jié)點的Degree越大潛在活性越大，部分活性化合物Degree見表1，可見Degree較高化合物有Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol等(Degree≥26)，是化濕敗毒顆粒發(fā)揮作用重要的潛在活性化合物。PTGS2、PTGS1、NCOA2、ESR1、AR、PPARG、NOS2、PRSS1、SCN5A等靶基因的Degree均大于40，是化濕敗毒顆粒作用的重要潛在靶基因。

2.4 活性靶點生物學(xué)功能GO及KEGG通路富集分析

將“2.2”項中得到的化濕敗毒顆粒237個潛在靶基因ID導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對化濕敗毒顆粒作用靶點可能存在的生物過程BP、細胞組分CC及分子功能MF進行生物過程GO富集分析(P<0.05)，分析得到GO條目共1 147個(P<0.05)，其中包括生物過程(BP)961個，分子功能(MF)110個，以及細胞組成(CC)76個，每種排名前10的條目見圖2。KEGG通路富集到170條信號通路(P<0.05)，排名前20的通路見圖3。由圖可見化濕敗毒顆粒作用涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF、C-type lectin receptor、HIF-1等信號通路。

注：紅色表示化濕敗毒顆粒活性成分，藍色表示靶點蛋白，邊代表相互關(guān)系。

圖2 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點GO基因功能分析

圖3 化濕敗毒顆粒潛在作用靶點KEGG通路富集分析

2.5 化濕敗毒顆粒抗2019-nCoV活性成分分子對接

以Degree排名前15的重要活性成分(Degree≥22)作為配體，分別以SARS-CoV-2病毒 3CLpro、ACE2及RdRp為受體進行分子對接。選取打分最高的構(gòu)象作為對接構(gòu)象，選取結(jié)合能較低且構(gòu)象較好的結(jié)果作為分子對接結(jié)果，選取作用明確的幾種3CLpro、ACE2及RdRp抑制劑作為對照。化濕敗毒顆粒重要活性成分分子對接結(jié)果見表2，由表2可見，與3CLpro親和力較好的成分有Kaempferol、Baicalein等；與ACE2親和力較好的成分有Shinpterocarpin、Stigmasterol等；與RdRp親和力較好的成分有Beta-sitosterol、Shinpterocarpin等，這些成分可能是抗COVID-19的關(guān)鍵活性成分。幾種關(guān)鍵活性成分與靶蛋白分子對接圖見圖4，由圖4可見，Kaempferol與3CLpro蛋白在SER-144、LEU-141及GLN-189位形成氫鍵；Stigmasterol與ACE2蛋白在LYS-562位形成氫鍵；Shinpterocarpin與RdRp蛋白在THR-246位形成氫鍵。此外，活性成分與靶蛋白還形成了多個Pi-Cation、Pi-Alkyl等鍵。這些化學(xué)鍵使受體配體形成較穩(wěn)定的結(jié)合。

圖4 SARS-CoV-2三種靶蛋白與化濕敗毒顆粒中關(guān)鍵活性成分分子對接模式

表2 化濕敗毒顆粒重要化合物及臨床治療藥物與3種靶蛋白及ACE2 的結(jié)合親和力

3 討論

COVID-19屬于中醫(yī)“瘟疫”范疇，具有典型濕毒致病的發(fā)病特點，并與運氣、氣候、地理及人群的易感性有關(guān)，涉及三焦、肺、胃、脾，在治療中應(yīng)采用群防群治與三因制宜相結(jié)合的措施[8]。其中醫(yī)病因病機是濕、毒、寒、熱、燥、虛、瘀，因此組方主要針對病毒的作用機理，化濕辟穢、宣肺通腑、活血解毒。化濕敗毒顆粒由多個經(jīng)典名方化裁而來，傳承了中醫(yī)理論精華。本方選取了宣白承氣湯、麻杏石甘湯中的部分藥物，能宣肺清泄、疏散上焦；選取了藿香正氣散、達原飲中化濕和胃的藥物，可斡旋中焦；選取了葶藶大棗泄肺湯藥物、桃仁承氣湯中部分藥物，可通達下焦、活血解毒；選取玉屏風(fēng)散及黃芪赤風(fēng)湯部分藥物，可扶氣補正、調(diào)理氣血、增強機體抵抗力。本方的動物實驗及臨床實驗也進一步證實，化濕敗毒顆粒對COVID-19具有良好的臨床療效和救治前景。

SARS-CoV-2需要 3CL 水解酶(3CLpro)來復(fù)制 RNA，是病毒的一個關(guān)鍵蛋白質(zhì)，若化合物與 3CLpro結(jié)合可大概率阻斷病毒復(fù)制，抑制病毒多蛋白裂解并防止傳播，為抗病毒藥物研發(fā)指明方向，因此本研究在微觀層面運用分子對接技術(shù)，挖掘化濕敗毒顆粒抗新型冠狀病毒的特異性及可能性。與3CLpro進行對接，結(jié)果提示Kaempferol、Baicalein等成分與3CLpro具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 3CLpro潛在抑制劑。

已有研究表明，新型冠狀病毒感染人體的關(guān)鍵在于SARS-CoV-2表面的S蛋白(刺突糖蛋白，Spike glyco-protein，簡稱S蛋白) 識別人類宿主的ACE2蛋白從而進入細胞，尤其是S蛋白結(jié)構(gòu)域的細胞受體結(jié)合區(qū)(Receptor binding domain，RBD)直接參與宿主受體的識別與人體ACE2蛋白的結(jié)合，即病毒通過其表面S蛋白與ACE2結(jié)合從而侵入人體[9]，目前，S蛋白和 ACE2蛋白已被確定為潛在的臨床試驗疫苗和治療靶點，其蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)成功解析，這就為通過電腦虛擬篩選針對這2種蛋白的抗病毒藥物提供了可能。清肺達原顆粒中有52基因為ACE2的共表達基因。本研究選取化濕敗毒顆粒中的化合物與SARS-CoV-2-S-RBD-ACE2進行分子對接，研究發(fā)現(xiàn)Stigmasterol、Shinpterocarpin等成分與ACE2具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 ACE2潛在抑制劑。

作為RNA 病毒，病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)對病毒的RNA 復(fù)制起關(guān)鍵作用，RdRp 抑制劑可作為抗RNA 病毒的廣譜抗病毒藥物。RdRp蛋白結(jié)構(gòu)中有一個大而深的凹槽結(jié)構(gòu)區(qū)作為RNA合成的活性中心。以RdRp作為靶點的藥物也是目前研發(fā)的熱點，Ribavirin及Remdesivir是目前正處于臨床研究的COVID-19病毒RdRp抑制劑。近期“清華大學(xué)-上海科技大學(xué)抗新冠病毒聯(lián)合攻關(guān)團隊”在全世界率先成功解析新型冠狀病毒“RdRp-nsp7-nsp8復(fù)合物”近原子分辨率的三維空間結(jié)構(gòu)，為本研究分子對接尋找化濕敗毒顆粒中RdRp抑制成分提供了蛋白基礎(chǔ)。分子對接結(jié)果提示Beta-sitosterol、Shinp-terocarpin等成分與RdRp具有較好的親和力，可作為SARS-CoV-2 RdRp潛在抑制劑。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對化濕敗毒顆粒抗COVID-19的作用機理進行了研究，并對化濕敗毒顆粒抗COVID-19具有較高度數(shù)的關(guān)鍵化學(xué)成分進行了篩選，并進一步采用分子對接的方式，以目前作用明確且已解析可得的3種蛋白3CLpro、ACE2及RdRp蛋白為靶蛋白，對化濕敗毒顆粒中Degree較高的重要活性成分進行了分子對接，篩選出關(guān)鍵活性成分。對接結(jié)果顯示，化濕敗毒顆粒中Degree較高的Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Formononetin等成分與靶蛋白均有一定親和力。Quercetin(槲皮素)是一種天然黃酮類化合物，可激活或抑制許多蛋白質(zhì)的活性，槲皮素可抑制流感病毒及HCV病毒[10]。Kaempferol(山奈酚)屬于黃酮類化合物，山奈酚可以抑制流感、HIV等病毒[11-12]。Luteolin(木犀草素)是一種天然黃酮類化合物，可以通過干擾外殼蛋白I復(fù)合物的表達在體外抑制甲型流感病毒[13]，還可以通過抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶抑制登革病毒復(fù)制[14]。Baicalein(黃芩素)是黃芩中含量較高的黃酮類化合物，黃芩素對流感病毒有抑制作用[16]，還具有抗登革病毒活性[15]。

化濕敗毒顆粒作為國家藥品監(jiān)督管理局首個批準(zhǔn)用于臨床的中藥復(fù)方，其作用機制和活性成分尚無研究，因此我們從兩方面探討化濕敗毒顆粒對抗COVID-19疾病的潛在機制及活性成分。一方面運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確活性成分及其靶蛋白，構(gòu)建化濕敗毒方的“成分-靶點-通路”多層次互作網(wǎng)絡(luò)；另一方面通過分子對接技術(shù)分析化濕敗毒方的活性化合物抗SARS-CoV-2的特異性及可能性，為后續(xù)進行體內(nèi)外實驗提供科學(xué)假設(shè)及理論依據(jù)，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥抗擊疫情的防治效果。