電感耦合等離子體質(zhì)譜法與砷鈰催化分光光度法檢測(cè)尿碘濃度的一致性

丁雙寧，毛金媛，李詠澤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

碘是甲狀腺激素合成的必需成分，通常可以通過食用含碘的食物或碘鹽獲得，碘攝入量過多或過少均可導(dǎo)致甲狀腺疾病的發(fā)生［1］。因此，了解人群碘營養(yǎng)狀況水平，對(duì)制定相關(guān)干預(yù)措施以減少碘缺乏病的流行極為重要。目前，大多數(shù)國家已經(jīng)實(shí)施了食鹽加碘政策和碘營養(yǎng)監(jiān)測(cè)［2］。

尿碘濃度（urinary iodine concentration，UIC）能夠反映人飲食中碘的攝入量，可作為人群中碘營養(yǎng)狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)之一［3］。目前，最常用的尿碘檢測(cè)方法是砷鈰催化分光光度（Sandell-Kolthoff，S-K）法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）［4-5］。S-K法檢測(cè)UIC的操作繁瑣、耗時(shí)長，而且砷和鈰具有明顯的化學(xué)危害性；另外，由于S-K法依靠化學(xué)動(dòng)力學(xué)測(cè)定碘濃度，因此易受鈰螯合以及改變反應(yīng)速率的有機(jī)物質(zhì)影響［6］。ICP-MS檢測(cè)UIC快速準(zhǔn)確，其精確度與S-K法相當(dāng)，而且樣品制備過程簡單，同時(shí)能夠進(jìn)行多種元素分析［7］。許多國家將ICP-MS作為尿碘檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是以往大量尿碘數(shù)據(jù)均是通過S-K法獲得，因此有必要對(duì)這2種方法測(cè)定的UIC進(jìn)行比較。

盡管人群UIC變化范圍不大（50～300 μg/L），但是個(gè)體之間以及個(gè)體內(nèi)的隨機(jī)UIC變化很大（10～1 000 μg/L）。S-K法的局限性在于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的上限為300 μg/L，如果樣品高于該值，則需要稀釋并重新測(cè)試，稀釋過程可能會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性［8］。一些研究［9-10］分析了ICP-MS與S-K法對(duì)UIC檢測(cè)結(jié)果的差異，但是這些研究的樣本量有限，并且沒有針對(duì)不同水平的UIC進(jìn)行分層。本研究評(píng)估并分析ICP-MS與S-K法檢測(cè)UIC的一致性，尤其是在不同UIC水平上，并根據(jù)歷史數(shù)據(jù)為將來預(yù)防和控制碘缺乏和碘過量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象來源于甲狀腺疾病、碘狀態(tài)和糖尿病的全國流行病學(xué)調(diào)查，本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)［11］詳細(xì)描述了調(diào)查方案。本研究于2015年至2017年進(jìn)行，共納入1 856例≥18歲的研究對(duì)象，平均年齡（45.70±14.70）歲，男性占39.20%，每個(gè)研究對(duì)象提供一份空腹尿液標(biāo)本。研究方案獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究排除妊娠婦女。向研究對(duì)象詳細(xì)解釋研究方案，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 S-K法檢測(cè)UIC：S-K法根據(jù)WS/T 107-2006標(biāo)準(zhǔn)，通過過硫酸銨（As3+-Ce4+催化分光光度法）進(jìn)行消化。所有化學(xué)試劑均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。所有樣品均采用UV-1600分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器集團(tuán)有限責(zé)任公司）進(jìn)行檢測(cè)。使用0.50、100、150、200、250和300 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液建立校準(zhǔn)曲線。如果樣品的UIC為300～600 μg/L，使用去離子水（比例1 ∶1，250 μL樣品加入250 μL去離子水）雙重稀釋尿液樣品；如果樣品UIC為600～1 200 μg/L，則將樣品稀釋4倍（比例1 ∶3，250 μL樣品加入750 μL去離子水），然后將250 μL稀釋樣品進(jìn)行消化并重新測(cè)定。UIC在66 μg/L時(shí)批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為3%～4%和4%～6%，UIC在230 μg/L時(shí)分別為2%～5%和3%～6%。

1.2.2 ICP-MS檢測(cè)UIC：通過Agilent ICP質(zhì)譜儀（Agilent 7700x，美國Agilent Technologies），使用八極桿反應(yīng)系統(tǒng)的碰撞模式進(jìn)行ICP-MS，測(cè)定UIC。檢測(cè)方法見文獻(xiàn)［9］。稀釋劑由1%氫氧化四甲基銨（瑪雅試劑）、0.01%Triton-X 100（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）組成，以10 μg/L碲［國標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司］作為內(nèi)標(biāo)。校準(zhǔn)物的濃度為0.10、25、50、100、200、300、400、800和1 000 μg/L，建立校準(zhǔn)曲線。尿液樣品和稀釋劑以1 ∶9比例稀釋（500 μL樣品和4 500 μL稀釋劑）。認(rèn)證的質(zhì)控品GBW09108、GBW09109和GBW09110［國標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司］目標(biāo)值分別為70.8、143和224 μg/L，測(cè)定內(nèi)變異系數(shù)分別為2.3%、1.4%和2.3%，相應(yīng)的測(cè)定間變異系數(shù)分別為2.7%、2.5%和2.4%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和MedCalc 15.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)S-K法測(cè)定的UIC，將樣品分為UIC＜300 μg/L、UIC 300～600 μg/L和UIC＞600 μg/L 3組，進(jìn) 行 分 層統(tǒng)計(jì)分析。分類變量采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和直方圖，對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。由于使用任何一種方法測(cè)定的UIC都是偏態(tài)分布，因此用M（P25～P75）表示，并進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析和非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Passing-Bablok相關(guān)圖和Bland-Altman差異圖評(píng)估ICP-MS與S-K法測(cè)定的UIC的一致性。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICP-MS與S-K法測(cè)定的UIC比較

ICP-MS測(cè) 定 的UIC范 圍為5.53～1 124.42 μg/L，中位數(shù)為159.47（101.98～247.93）μg/L。S-K法測(cè)定的UIC范 圍 為5.0～1 189.0 μg/L，中 位 數(shù) 為149.85（95.83～227.88）μg/L。ICP-MS測(cè)定的UIC中位數(shù)高于S-K法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.000 1）。

當(dāng)UIC＜300 μg/L時(shí)，ICP-MS測(cè)定的UIC中位數(shù)高于S-K法（143.29和135.10 μg/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。當(dāng)UIC為300～600 μg/L時(shí)，ICP-MS測(cè) 定的UIC中位數(shù)低于S-K法（406.96和423.40 μg/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。當(dāng)UIC＞600 μg/L時(shí)，ICPMS測(cè)定的UIC中位數(shù)低于S-K法（674.29和753.65 μg/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。見表1。

表1 ICP-MS與S-K法測(cè)定的UIC結(jié)果比較（μg/L）Tab.1 Comparison of UIC measured by ICP-MS and the S-K method

2.2 ICP-MS與S-K法檢測(cè)UIC一致性的Passing-Bablok回歸分析

Passing-Bablok回歸圖顯示了2種方法測(cè)定的UIC的相關(guān)性。2種方法的Passing-Bablok回歸方程均為y=0.36+1.04x（x為S-K法，y為ICP-MS）。通過計(jì)算回歸截距95%CI（截距為0.36，95%CI：-1.82～2.29）評(píng)估常數(shù)項(xiàng)差異，斜率為1.04（95%CI：1.03～1.06），Spearman相關(guān)系數(shù)為0.95（95%CI：0.94～0.96，P＜ 0.001）。見圖1。

圖1 ICP-MS與S-K法檢測(cè)UIC一致性的Passing-Bablok回歸圖和Spearman的相關(guān)系數(shù)Fig.1 Passing-Bablok regression curve of the consistency of UIC detected by ICP-MS and the S-K method with Spearman’s correlation coefficient

2.3 ICP-MS與S-K法檢測(cè)UIC差異的Bland-Altman分析

Bland-Altman圖顯示了2種方法測(cè)定的UIC的差異，平均差異值為6.08 μg/L（95%CI：4.24～7.92 μg/L）。2種方法測(cè)定的UIC的差異呈濃度依賴性。95%一致性界限（即由平均差異±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差定義的間隔）表明，ICP-MS和S-K法測(cè)定的UIC的差異在-73.11～85.27 μg/L之間變化。見圖2。

圖2 ICP-MS和S-K法檢測(cè)UIC差異的Bland-Altman圖Fig.2 Bland-Altman plot for determining the UIC difference between ICP-MS and the S-K method

2.4 分層分析

根據(jù)S-K法測(cè)定的UIC水平，對(duì)Passing-Bablok回歸、Bland-Altman圖和Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分層分析。

2.4.1 S-K法測(cè)定UIC＜300 μg/L：2種方法的Passing-Bablok回歸方程為y=-9.04+1.14x（x為S-K法，y為ICP-MS），Passing-Bablok回歸顯示2種方法的檢測(cè)一致性非常高。Spearman相關(guān)系數(shù)為0.93，高于UIC 300～600 μg/L和UIC≥600 μg/L時(shí)的相關(guān)系數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。2種方法測(cè)定的UIC的平均差異為10.98 μg/L（95%CI：9.45～12.52 μg/L）。見表2。

2.4.2 S-K法測(cè)定UIC在300～600 μg/L之間：2種方法的Passing-Bablok回歸方程為y=-10.32+1.00x（x為S-K法，y為ICP-MS），Passing-Bablok回歸顯示2種方法的檢測(cè)一致性很高。Spearman相關(guān)系數(shù)為0.80，低于UIC＜300 μg/L時(shí)的相關(guān)系數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。2種方法測(cè)定的UIC的平均差異為14.43 μg/L（95%CI：6.07～22.79 μg/L）。見表2。

2.4.3 S-K法測(cè)定UIC＞600 μg/L：2種方法的Passing-Bablok回歸方程為y=-156.25+1.10x（x為S-K法，y為ICPMS），Passing-Bablok回歸顯示2種方法的檢測(cè)一致性較高。Spearman相關(guān)系數(shù)為0.84，低于UIC＜300 μg/L時(shí)的相關(guān)系數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。2種方法測(cè)定的UIC的平均差異為-74.55 μg/L（95%CI：-98.20～-50.90 μg/L）。見表2。

表2 Passing-Bablok回歸、Bland-Altman圖和Spearman相關(guān)系數(shù)的分層分析Tab.2 Stratified analysis of Passing-Bablok regression，Bland-Altman plot，and Spearman’s correlation coefficient

3 討論

在以往的人群碘營養(yǎng)監(jiān)測(cè)中，主要使用S-K法檢測(cè)人體UIC，但是該方法的樣品制備過程較為繁瑣。ICP-MS測(cè)定人血漿和尿液中碘濃度的靈敏度、線性和重現(xiàn)性，已在相關(guān)研究中得到證實(shí)［12-13］。本研究在納入人群中發(fā)現(xiàn)ICP-MS和S-K法測(cè)定UIC的一致性，盡管回歸線接近于二等分線，2種方法之間的斜率系數(shù)（與斜率=1比較）仍有顯著差異，這可能與2種方法對(duì)濃度依賴性的差異有關(guān)。Bland-Altman圖顯示，ICP-MS測(cè)定的UIC比S-K法測(cè)定的UIC高6.12 μg/L，這種差異在臨床檢查中是可以接受的。因此，筆者認(rèn)為ICP-MS和S-K法檢測(cè)UIC具有很好的一致性，可以直接比較這2種方法的檢測(cè)結(jié)果。S-K法測(cè)定的UIC＜300 μg/L與ICP-MS測(cè)定結(jié)果之間的差異，可能是過硫酸銨與高氯酸的弱氧化能力造成的，因?yàn)榈饣镄枰焖儆行У匮趸癁榈馑猁}，以防止碘在通過S-K法進(jìn)行光度檢測(cè)之前揮發(fā)。

S-K法測(cè)定UIC＜300 μg/L時(shí)，低于ICP-MS測(cè) 定的UIC值，與之前研究［9］的結(jié)果有所不同，這可能是與先前的研究樣本量較小、缺少足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)效能有關(guān)。每種方法都使用了一系列不同的參數(shù)，并且標(biāo)準(zhǔn)操作程序略有不同。但是，S-K法測(cè)定UIC≥300 μg/L時(shí)，高于ICP-MS測(cè)定的UIC值，這可能與S-K法進(jìn)行尿液樣品稀釋有關(guān)，因?yàn)槟蛞簶颖局泻行枰獧z測(cè)的碘以及不需要檢測(cè)并可能會(huì)干擾S-K法的雜物（如有機(jī)物、蛋白質(zhì)、氨基酸），干擾物質(zhì)可能會(huì)減慢鈰發(fā)色團(tuán)的生成，使樣品中的碘含量低于真實(shí)值；UIC≥300 μg/L的樣品在消化前要進(jìn)行2倍或4倍稀釋，稀釋樣品中碘的同時(shí)也稀釋了減慢S-K法的干擾物質(zhì)，因此反應(yīng)加快，碘的測(cè)量值增加。而ICP-MS檢測(cè)相同的樣品時(shí)以恒定的方式稀釋，不會(huì)隨樣品濃度的變化而變化。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，稀釋度越大、偏差越大。S-K法測(cè)定UIC在300～600 μg/L之間時(shí)，2種方法檢測(cè)UIC的平均差異為14.43 μg/L；當(dāng)UIC＞600 μg/L時(shí)，平均差異達(dá)到-74.55 μg/L，這在臨床實(shí)際檢查中是不可接受的。

使用不同方法測(cè)定UIC的差異可能是由多種原因引起的，以下因素可能起了重要作用。尿基質(zhì)用水稀釋，先前的研究表明［14］，用水稀釋的高UIC樣品通過S-K法測(cè)定的結(jié)果顯著高于稀釋后的低UIC樣品。另一項(xiàng)研究［15］表明，氧化劑不足會(huì)導(dǎo)致尿液中不飽和的灰分成分受到干擾，從而導(dǎo)致高濃度的假碘在尿液中產(chǎn)生。這種變化可能會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生影響，因?yàn)閷?duì)碘強(qiáng)化計(jì)劃的監(jiān)測(cè)通常著重于人群UIC中位數(shù)。在1988年至1994年進(jìn)行的NHANES Ⅲ中，采用S-K法測(cè)定的人口UIC中位數(shù)為144.7 μg/L。但是，在2001年至2002的NHANES中，使用ICP-MS測(cè)定發(fā)現(xiàn)人口UIC中位數(shù)增加到167.8 μg/L。檢測(cè)方法之間的差異可能在某種程度上導(dǎo)致了人口UIC中位數(shù)增加，這表明準(zhǔn)確的UIC測(cè)定對(duì)公共衛(wèi)生政策的制定至關(guān)重要。由于這種變化對(duì)攝入過量碘的人更加明顯，而碘強(qiáng)化計(jì)劃對(duì)缺碘的人更重要。因此，2種方法都可以可靠地量化UIC。

綜上，本研究結(jié)果顯示，ICP-MS和S-K法測(cè)定的UIC具有可比性，特別是當(dāng)UIC＜300 μg/L（覆蓋正常成人UIC范圍）時(shí)，可以直接比較這2種方法的測(cè)定結(jié)果；當(dāng)UIC介于300～600 μg/L之間時(shí)，在考慮到研究目的后，應(yīng)謹(jǐn)慎比較UIC的結(jié)果；當(dāng)UIC＞600 μg/L時(shí)，不建議在碘監(jiān)測(cè)研究中比較ICP-MS和S-K法測(cè)定的UIC。然而，本研究尚存在一定的局限性：首先，無法分析可能影響測(cè)定結(jié)果的其他潛在影響因素（藥物、疾病等）；其次，沒有驗(yàn)證通過S-K法獲得的用水稀釋的高UIC樣品的測(cè)定值是否顯著高于用水稀釋的低UIC樣品，這可能有助于解釋觀察到的UIC測(cè)定值的差異；最后，由于本研究僅選擇過硫酸銨作為消化物質(zhì)，因此不同消化方法可能導(dǎo)致S-K法UIC測(cè)定結(jié)果不同。在未來，應(yīng)該使用標(biāo)準(zhǔn)UIC檢測(cè)方法和有足夠統(tǒng)計(jì)學(xué)效能的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究，以獲得ICP-MS和S-K法之間測(cè)定UIC更精確的轉(zhuǎn)換公式，進(jìn)行歷史數(shù)據(jù)的比較。