TERT基因在乳頭狀腎細胞癌中的獨立預后作用

劉殿勇，張帥，許亞坤，高莉娟，楊進益，魏偉

（大連醫科大學 1.附屬大連市兒童醫院泌尿外科，遼寧 大連 116012；2.附屬大連市友誼醫院泌尿外科，遼寧 大連 116100）

腎乳頭狀細胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）是腎癌的第二常見類型，約占腎癌病例總數的15%～20%［1］。PRCC是一種異質性疾病，其潛在的分子機制還不完全清楚［2］。此外，靶向治療對晚期PRCC患者的療效尚不確定。目前，人們對確定PRCC患者預后的最佳風險基因特征尚未達成共識［3］。因此，迫切需要尋找新的預后生物標志物和治療靶點來提高PRCC患者的生存率。

隨著高通量基因檢測技術的發展，生物醫學大數據被廣泛應用［4-5］。從單個樣本中收集大量的基因組信息，從而可以識別新的預后、預測或藥效生物標志物［6］。目前，基因表達水平的微陣列或RNA測序數據常用于通過Cox風險回歸模型構建新的預后特征。通過微陣列和測序方法以及可用的開放存取數據庫如癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），已經在PRCC等多種癌癥中發現生物標志物，為在全球基因水平上篩選預后基因提供了機會［7］。

本研究利用TCGA數據庫中PRCC患者的基因表達譜數據和臨床信息，對正常人和PRCC患者的基因進行差異分析，基于差異基因篩選與患者生存顯著相關的基因，并進一步探討該基因是否能成為新的PRCC預后標志物，為PRCC患者的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人膠質瘤細胞系SK-RC-39（中國科學院上海細胞所）。

1.1.2 主要試劑：高糖DMEM培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公 司）；TRIzol試 劑、Lipofecamine 2000、cDNA-TERT和陰性對照（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉錄試劑盒以及 SYBR PCR Master Mix（寶生物工程有限公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染：細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，于5% CO2、37 ℃培養箱內培養和傳代。按Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明進行cDNA轉染，誘導TERT過表達。

1.2.2 Western blotting：將轉染和未轉染TERT的細胞培養48 h后，裂解并提取蛋白，檢測TERT蛋白的表達。

1.2.3 MTT方法檢測細胞增殖：將轉染和未轉染TERT的細胞在96孔板中按照5×103/孔進行鋪板，培養24、48、72、96 h后，加入MTT（5 mg/mL），隨后溶于DMSO（100 μL/孔），酶標儀檢測各孔吸光度值（490 nm波長），實驗重復3次。

1.3 生物信息學分析

通過TCGA數據庫（http：//cancergenome.nih.gov）下載PRCC患者的RNA-seq數據和臨床數據，包含289例PRCC患者和32例正常人。排除5例無總體生存期（overall survival，OS）的患者樣本，共有284例PRCC患者樣本納入分析。基因表達值以每100萬標記讀本中每千堿基外顯子的讀本數進行估算。此外，不同樣本間通過中位數法進行標準化處理。RNA-seq原始數據集用R語言edgeR包進行處理，對原始數據進行背景校正、標準化。錯誤發現率（false discover rate，FDR）＜0.05視為差異有統計學意義。

將差異基因投入到單因素Cox風險回歸分析中，進一步利用R語言survival包繪制Kaplan-Meier曲線，通過log-rank檢驗TERT低表達和高表達2組患者的生存時間有無統計學差異。然后利用R語言pROC包繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，篩選出與PRCC患者OS相關的獨立預后基因。此外，將臨床病理參數（TNM分期、性別和年齡）作為協變量進行單因素和多因素Cox風險回歸分析，鑒定獨立預后風險因素。

1.4 統計學分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，2組比較采用Student’st檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初步篩選出16個生存相關差異基因

從TCGA數據庫中下載PRCC患者的基因表達譜數據和臨床信息。通過對284例PRCC患者和32例正常人基因進行差異分析，采用嚴苛的標準篩選出74個差異表達的基因（log FC＞5，FDR＜0.05），見圖1A。經過進一步Cox風險回歸分析，發現這74個差異基因中有16個與患者生存相關（P＜ 0.05），見圖1B。其中14個基因風險比（hazard ratio，HR）＞1，表明隨著基因表達量增加，患者死亡風險增加。

圖1 初步篩選出16個生存相關差異基因Fig.1 Preliminary screening of 16 survival related genes

2.2 生存相關差異基因的預后分析

基于Kaplan-Meier生存曲線，進一步分析16個基因的表達水平與PRCC患者OS的相關性。結果提示，只有TERT基因和VSTM2L基因的表達水平與PRCC患者OS相關。TERT高表達與PRCC患者OS較短相關（P=0.009，圖2A），且ROC曲線表明，TERT基因可以準確預測患者的預后［曲線下面積（area under the curve，AUC）=0.713］。而VSTM2L基因的表達水平雖然與PRCC患者OS相關（P=0.004），但ROC曲線表明，VSTM2L基因不能準確預測患者生存（AUC=0.381）。以上結果表明，TERT基因可以準確預測PRCC患者預后。

圖2 TERT基因和VSTM2L基因對PRCC患者生存的預測作用Fig.2 The survival predictive effect of TERT and VSTM2L genes in PRCC patients

2.3 TERT基因對PRCC的獨立預后作用

與正常人相比，PRCC患者中TERT基因表達增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖3A。PRCC患者中，隨著TERT表達量增加，患者生存時間縮短，死亡人數增加，這與之前證明的TERT是風險因素（HR＞1）的結果一致。隨后，為了證實TERT基因不受臨床因素影響，可以作為獨立風險因素預測患者的預后，將TERT基因及臨床病理參數（TNM分期、性別和年齡）投入到單因素Cox風險回歸分析中，發現TERT基因（P=0.029，圖3C）、N分期（P=0.001，圖3C）和T分期（P＜ 0.001）與PRCC患者OS顯著相關。多因素Cox回歸分析結果提示，TERT基因（P=0.005，圖3D）和N分期（P=0.011，圖3D）具有獨立預測PRCC患者OS的潛在作用，TERT高表達提示PRCC患者具有高死亡風險。

圖3 TERT基因對PRCC的獨立預后作用Fig.3 Independent prognostic effect of TERT gene on PRCC

2.4 誘導PRCC細胞中TERT表達后增殖活性增加

上述結果提示TERT在PRCC中可能發揮促癌基因作用，進一步通過細胞實驗進行驗證。將cDNATERT轉染至SK-RC-39細胞中，Western blotting結果發現，與未轉染組比較，細胞轉染cDNA-TERT后TERT表達明顯增加（圖4A），即有效誘導細胞中TERT高表達。接下來，通過MTT方法檢測細胞增殖水平的改變，結果發現，TERT基因過表達可使SK-RC-39細胞增殖活性增加（圖4B），提示TERT可能通過調控細胞增殖活性發揮促癌作用。

圖4 TERT過表達對PRCC細胞細胞增殖的影響Fig.4 Effect of TERT overexpression on proliferation of PRCC cells

3 討論

PRCC是第二常見腎癌類型，但由于病例數有限，關于PRCC的分子機制研究和隨機臨床試驗很少［8］。因此，與PRCC進展相關的分子機制尚不清楚［9］。盡管目前臨床存在多種PRCC治療方法，但患者預后不良［10］。因此，迫切需要尋找有效的預后生物標志物，以便準確預測預后，提高PRCC患者的生存率。

近10年來，RNA測序及基因芯片等技術不斷成熟，其準確度和精確度都大幅提高，形成了癌癥相關的大數據［5，11］。利用生物信息學手段挖掘這些大數據，可以方便地找到可能與PRCC發生、發展相關的基因。與傳統研究相比，更加經濟且有效地縮短了研究周期。目前，已有多篇文獻［12-15］基于生物信息學對PRCC進行預后分析。

本研究中，基于PRCC患者和正常人的基因表達數據，初步篩選出74個差異表達基因。進一步采用單因素Cox風險回歸分析，篩選出16個基因與患者生存相關。隨后，Kaplan-Meier生存分析發現只有TERT基因（P=0.009）和VSTM2L基因（P=0.004）可以預測患者生存。但是ROC曲線證實，僅TERT基因可以準確預測PRCC患者預后（TERT：AUC=0.713；VSTM2L：AUC=0.381），即TERT高表達患者的OS較TERT低表達患者明顯縮短。對臨床因素進行單因素和多因素Cox風險回歸分析發現，TERT（P=0.005）和N分期（P＜ 0.001）是PRCC患者的獨立預后因素。

總之，本研究系統證明了TERT基因與PRCC進展顯著相關。TERT基因可以準確、獨立地預測PRCC患者的預后。本研究結果表明，TERT基因是PRCC潛在的診斷和預后生物標志物，為今后對PRCC的基礎研究和臨床輔助治療提供了參考。但本研究僅基于生物信息學分析，需要更大樣本的同類數據進行驗證，并同時開展相關的臨床和基礎實驗，以確認這些指標的穩定性和實用性。