血清HMGB1 miR-200c-3p及cTnⅠ水平對新生兒呼吸窘迫綜合征預后的預測價值

霍惠儀，盧泳雪

(廣東省佛山市第一人民醫院新生兒科，廣東 佛山 528000)

新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是指新生兒出生不久即出現的由于原發或繼發的肺泡表面活性物質減少導致的進行性呼吸疾病，表現為呼吸困難、呼吸衰竭，呻吟發紺吸氣三凹征[1,2]。具有病情嚴重、發展快速、死亡率高的特點，嚴重威脅新生兒生命，且經搶救存活的患兒肺功能與神經系統亦受損害，對未來生長發造成影響[3]。因此尋找簡單有效的評估指標對NRDS進行病情與預后評估十分重要。研究表明：炎性介質與細胞因子在NRDS的病例發展中有重要作用[4]。基于此，本研究旨在探究血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平對NRDS預后的預測價值，為預防和降低NRDS風險提供參考，現將研究成果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年1月至2019年12月本院收治的NRDS患兒120例，根據患者病情分為輕度組(胸片結果為Ⅰ、Ⅱ級)、重度組(胸片結果為Ⅲ、Ⅳ級)，各72、48例。另選取同期本院產科出生正常新生兒40例為對照組。其中輕度組患兒男性35例、女性37例，胎齡32～40周，平均(35.28±2.57)周，出生體重1.5～5.1kg，平均(2.58±0.85)kg，自然分娩38例、剖宮產34例；重度組患兒男性22例、女性26例，胎齡31～40周，平均(34.69±2.23)周，出生體重1.5～5.2kg，平均(2.38±0.93)kg，自然分娩21例、剖宮產27例；對照組患兒男性19例、女性21例，胎齡33～39周，平均(35.87±1.01)周，出生體重2.5～4.5kg，平均(3.02±0.35)kg，自然分娩23例、剖宮產17例。

1.2納入和排除標準:納入標準：①經我院診斷確診的NRDS患兒，符合《實用新生兒學》的標準；②出生不久出現呼吸進行性困難，呻吟吸氣發紺三凹征；③X線胸片檢查表現為雙肺彌漫性陰影、毛玻璃顆粒狀，透明度降低，無心房高壓；④患者臨床資料完整；⑤動脈氣血分析提示血氧下降，二氧化碳分壓上升。排除標準：①肺外嚴重感染患兒；②先天性臟病、代謝紊亂患兒；③肺怕表面原發性活物缺乏患兒；④先天畸形、肺和胸壁畸形患兒。本研究征得院醫學倫理委員會批準。

1.3方 法

1.3.1臨床資料：入院后收集患兒一般資料，包括年齡，入院胎齡、體重、分娩方式、及母親相關資料等。

1.3.2樣本采集：采集新生兒出生后6h內的外周靜脈血5mL，置于凝管中靜置30min，離心(3000rpm/min)10min后裝于EP管中，于-80℃下保存備測。①使用用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清HMGB1水平。②根據逆轉試劑盒說明進行轉錄定量RNA，內參U6；反應體系(15 μL)：無菌三蒸水(4.16 μL)、U6及miRNA特異性莖環引物(3 μL)、10×反轉錄緩沖液(1.50 μL)、RNA模板(5μL)、50U/μL逆轉錄酶(1.00μL)、20U/μL RNase抑制劑(0.19μL)、100mmoL/L脫氧核糖核苷酸(0.15μL)。反映參數：分別于16℃、42℃、85℃中反應30min、30min、5min，于4℃恒溫放置，每1個循環1反應。在熒光定量PCR儀上(ABI熒光定量儀Qubit4.0南京貝登電子商務有限公司)進行定量聚合酶鏈反應，反應體系(20μL)：TaqMan通用混合物溶液(10μL)、無核酸酶水(7.67μL)、引物及20×探針Mix(1μL)、反轉錄產物(1.33μL)；擴增條件：分別于95℃、95℃、60℃中進行預變性、變性、復性循環，次數為1個、45個、45個，每個循環分別進行10min、15s、60s。實驗進行3次，miR-200c-3p水平表達相對值采用2-ΔΔCt法計算。③靜脈血離心11min后取上清液，采用全自動生化分析儀(濟南童鑫生物科技有限公司)檢測cTnⅠ水平，參考值為0.02～0.13ng/mL。所有實驗試劑盒均供自上海酶聯生物科技有限公司。

1.4觀察指標:NRDS影像分級[5]：Ⅰ級：雙肺透亮度減低，可見均勻網狀陰影與細小顆粒；Ⅱ級：病變至肺野中外帶，且有支氣管充氣征；Ⅲ級：雙肺透亮度明顯降低，病變加深，出現膈面、心緣模糊；Ⅳ級：雙肺呈白肺狀，支氣管充氣征嚴重似禿葉樹枝。

2 結 果

2.1三組血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較:結果顯示：三組在血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較存在明顯差異(P<0.05)，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平重度組>輕度組>對照組，見表1。

表1 三組患者血清HMGB1 miR-200c-3p及cTnⅠ水平比較

2.2兩組NRDS患者臨床資料比較:住院期間，120例NRDS患者共34例(28.33%)死亡，86例(71.67%)存活。其中死亡患者中，輕度組5例、重度組29例。兩組患者的年齡、性別、出生體重、母親年齡、剖宮產、出現呼吸困難時間、母親糖尿病、母親高血壓、胎糞吸入、宮內窘迫、新生兒窒息、等相比較均無明顯差異(P>0.05)，但兩組在病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平的差異間具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者臨床資料比較

2.3NRDS患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析：以“死亡組”為因變量(賦值：0=是，1=否)，以“病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平”為自變量，納入Logistic回歸分析。多因素Logistic回歸分析顯示病情、HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平均為NRDS患者預后的相關影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 NRDS患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平與三項聯合對NRDS患者預后的預測價值:ROC曲線分析顯示，HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平對NRDS患者的預測的AUC為0.933、0.892、0.766，具有較高準確性；以約登指數的最大切點作為最佳臨界值，該點預測，HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平敏感度、特異度：為91.2%82.4%/50.0%、91.9%/100.0%100.0%，預測具有較高價值。將HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平納入Logistic回歸模型，通過三項指標的logistic回歸模型得出三項聯合的數值：計算公式為：三項聯合=14.224+(-0.019)*HMGB1+(-1.011)*miR-200c-3p+(-12.049)*cTnⅠ，統計分析得出聯合數據。進一步ROC曲線顯示，三項聯合預測AUC為0.937，敏感度、特異度為82.4%、98.8%，預測價值較高。見表4、5，圖1。

表4 HMGB1 miR-200c-3p cTnⅠ水平與三項聯合對NRDS患者預后的預測價值

表5 HMGB1 miR-200c-3p cTnⅠ水平與三項聯合對NRDS患者預后的預測價值的效能分析

圖1 HMGB1、miR-200c-3p、cTnⅠ水平與三項聯合對NRDS患者預后的預測價值

3 討 論

NRDS病發高危因素包括早產，肺表面活性物質缺乏、缺氧、炎癥反應等，使多種因素共同參與的結果。通常情況下，新生兒肺功能成熟度較低，肺表面活性物質較少，NRDS病發時易病發肺炎，使病情加重，影響預后生存[6]。

血清HMGB1是炎性介質的一種，通過免疫細胞分泌釋放入胞漿與胞外，參與肺損傷炎癥反應，具有調節作用。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是新型基因調控因子，可通過調節靶基因表達參與炎癥通路與免疫應答調控[7]。心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)是評價心肌損傷與預后轉歸的生化常用指標。本研究通過將輕度NRDS患兒，重度NRDS患者與健康組對比，結果顯示：血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平重度組>輕度組>對照組。提示NRDS患兒病發體內血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平呈現高表達，隨病情加重，表達水平數值升高，可將HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平作為NRDS診斷新靶點。分析原因為[8]：①NRDS病發時，肺功能發生障礙，出現缺氧癥狀，引發肺血管損傷，大量炎性因子釋放，HMGB1升高；②miRNA在NRDS病發炎癥反應中，參與表皮細胞病理過程，在細胞分化凋亡血管生成中發揮重要作用；③新生兒心肌細胞對缺氧敏感度高，NRDS患兒病發缺氧且伴隨炎癥反應，增加肺循環阻力，導致循環障礙與代謝異常，增加心肌細胞通透性，造成心肌缺氧損傷，cTnⅠ水平上升。且病情越嚴重，心肌缺氧損傷越重，cTnⅠ水平越高。

本研究預后情況：住院期間，120例NRDS患兒共34例(28.33%)死亡，86例(71.67%)存活，通過對比生存死亡組資料，結果顯示，兩組患者在血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平存在差異，死亡組顯著高于生存組，與上文所述具有一致性，患兒病情加重，死亡風險增加，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平皆呈現高表達。有研究表明：HMGB1、miR-200c-3p參與NRDS細胞炎癥反應，且患兒病情加重，炎癥與心損加重，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平升高，與本文結論一致[9]。另ROC曲線顯示，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平對NRDS患兒的預后評估具有一定的價值，且聯合檢測預測價值更高。分析原因為：血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平與NRDS患兒病情嚴重程度相關密切，可作為預后標志物。王文秀研究亦表明：巨噬細胞活化后4h產生HMGB1，18-24達高峰，能一段時間內存于體內，參與肺損傷等炎癥反應，且具有警報素功能，濃度高低可反應病情、組織損傷程度，與預后相關密切[10]。

綜上所述，血清HMGB1、miR-200c-3p及cTnⅠ水平在NRDS患兒中呈高表達，且與病情程度相關密切，具有較高的預后預測評估價值。