饑餓誘導的魏斯氏菌差異轉錄組

潘金微，趙玲艷，馬丁，王增光，鄧放明

(湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙，410128)

魏斯氏菌(Weissella)是乳酸菌的一種，在醬油、泡菜、豆豉和香腸等發酵食品中廣泛存在[1]，不僅能夠提高發酵食品產品質量或者縮短發酵周期還可以賦予食品獨特的風味[2]，并且具有合成細菌素[3]、產胞外多糖[4]、降膽固醇[5]、降甘油三酯[6]和抑制炎癥水平[7]等益生特性。

轉錄組測序(RNA-Seq)技術通過對細胞轉錄產物進行測序，統計測得細胞在某一特定時間特定條件下每個轉錄本的表達量[8]，有助于精準評估細胞表型和對目標基因進行改良[9]，有低成本、高通量、準確、快速的特點[10]。通過轉錄組測序，比較菌體在不同環境、不同刺激物作用下基因表達量的差異，并對其進行注釋和富集分析，可以研究環境及刺激物對菌體的影響及作用機理[11]。近年來，隨著RNA-Seq技術和生物信息學分析方法的不斷成熟，轉錄組測序因其檢測動態范圍寬、數據重復性好而被廣泛應用于乳酸菌研究領域，逐漸成為基因表達差異研究、功能注釋和代謝機制分析的重要手段，為深入理解微生物蘊含的分子機制提供了可信的證據[11-15]。陳興麟等[16]通過轉錄組測序發現新瓊四糖和新瓊六糖在促進乳酸菌生長的作用機理上具有極大的相似性。田源等[17]利用宏轉錄組揭示了在濃香型白酒窖內發酵過程中與正丙醇合成有關的微生物與代謝途徑。目前對魏斯氏菌轉錄組方面的研究仍然比較匱乏。本實驗通過轉錄組測序技術分析比對了魏斯氏菌10d-17在饑餓及正常狀態下RNA轉錄表達情況，篩選差異基因，對差異基因進行GO(Gene Ontology)注釋和代謝路徑KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋，從而闡明在關鍵代謝路徑中基因轉錄水平的變化，探究關鍵基因和蛋白參與代謝模式的調控及其調控方式。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

魏斯氏菌(Weissella)由本課題組從前期實驗的發酵剁辣椒中分離得到。

1.2 試劑盒及儀器

Qubitarna分析試劑盒，美國加利福尼亞州生命技術公司；RNA提取試劑盒，Clontech(USA)；RNA Nano6000檢測試劑盒、安捷倫生物分析儀2100，安捷倫技術公司(美國)；RNA保護劑，ZYMO RESEARCH(USA)；Qubit?RNA分析試劑盒，IMPLEN(USA)；Qubi 2.0熒光計，Invitrogen(USA)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化

將保藏的菌種從-80 ℃冰箱取出，于4 ℃解凍30 min，吸取適量菌液于MRS液體培養基中于恒溫培養箱中37 ℃培養12 h，然后劃線分離，挑取單菌落液體培養，如此反復操作3次，得到活化后的種子液。

1.3.2 樣品的制備

饑餓處理組：按1.3.1方法活化后，參考ERCAN等[18]研究方法，取10 mL菌液，于4 ℃ 8 000 r/min離心后去上清液，0.9%生理鹽水洗脫2次，離心后取菌泥靜置菌2 h。后加入RNA保護劑(保護劑添加比例為1∶1)，4 ℃ 8 000 r/min離心后去上清液，迅速放入液氮中冷凍(后續測序結果中以J-菌種編號標記)。

正常培養組：菌種按1.3.1的方法活化后，饑餓處理2 h后，按1%接種量接入10 mL已殺菌培養基中，培養8 h。后4 ℃ 8 000 r/min離心取菌泥，添加RNA保護劑，離心后去上清液，放入液氮中冷凍保藏(后續測序結果中以Z-菌種編號標記)。每1株菌株每1種處理做3份平行。

1.3.3 RNA的質量檢測

使用1%的瓊脂糖凝膠檢測提取的RNA樣品是否降解或被污染，然后用Nano光度計?分光光度計檢查RNA純度，Qubit?2.0熒光計測量RNA濃度[19]。質量檢測最后采用安捷倫生物分析儀評估RNA完整性。

1.3.4 建立測序文庫及測序

RNA的質量檢測后，使用Ribo-zero試劑盒和fragmentation buffer去除rRNA，使被打斷成短片段的mRNA富集。以mRNA為模板，在反轉錄酶試劑盒作用下，用六堿基隨機引物合成第1條cDNA鏈。利用Qia Quick PCR試劑盒和緩沖液合成純化第2條cDNA鏈，并加EB緩沖液洗后進行末端修復，添加poly A連接測序接頭，用AMPure XP beads進行片段大小選擇，進行PCR擴增,得到最終的測序，并利用Ilumina hiseq 2000平臺對樣品進行高通量測序。然后去除原始數據中不合格的Reads，得到高質量的Clean Reads，并利用Bowtie2軟件將高質量的Clean Reads進行基因比對分析。通過HT seq將比對基因組的Reads進一步定位到基因上，統計每個基因比對的Reads數，通過FPKM值表示基因的表達量，并對基因結構和表達水平進行分析。在有生物學重復的條件下，以P<0.05作為閾值篩選差異基因，并對其進行GO富集分析及KEGG富集處理。

2 結果與分析

2.1 樣品RNA質量檢測結果

魏斯氏菌做饑餓和全營養2種處理，每組3個平行，共6個樣本。由表1可知，每個樣品RNA總量均≥6 g(3 g為合格)，質量濃度≥200 g/L。同時OD260/280均>1.5，RNA完整值(RNA integrity number，RIN)≥8(≥6為合格)，且total RNA條帶清晰，說明RNA質量符合后續測序要求。

表1 樣品RNA質量情況Table 1 RNA quality of samples

2.2 RNA-seq測序質量結果

由表2可知，魏斯氏菌做饑餓和全營養2種處理，每組3個平行，每1組高通量測序獲得的原始測序數據量都在1.7 GB以上，單個堿基位置的測序錯誤率為0.02%，其中Q20(Phred數值大于20的堿基占總體堿基的百分比)均在98.36%以上，質量值在Q30也都高于94.65%。去除含有帶接頭的、低質量的序列后，各組得到的高質量reads數為983萬～1 359萬條。從RNA-seq測序質量結果來看，本次測序的數據飽和度高，符合開展后續轉錄本拼接實驗的要求。

表2 不同樣品RNA-seq數據產出質量情況表Table 2 Output quality of RNA-seq data of different samples

2.3 魏斯氏菌10d-17 RNA-seq相關性檢查

轉錄組測序結果要求生物學實驗操作是可重復的，并且變異不大。同時為確保后續的差異性基因分析結果的準確性，可以通過繪制皮爾遜相關系數圖，來檢驗樣品間的基因表達水平的相關性。由圖1可知，各個樣品間生物學重復皮爾遜相關系數均≥0.97,實驗重復性好。

2.4 魏斯氏菌轉錄結果分析

2.4.1 組間差異表達基因分析

為了使不同的基因和實驗之間估計的基因表達水平有可比性，本實驗除了用reads計數來估計基因的表達水平外還加入了FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)的概念，用FPKM值是否≥1作為判斷基因表達的標準。這株魏斯氏菌注釋到結構中73%以上的基因的FPKM值>1[20]。本實驗為了揭示饑餓處理對魏斯氏菌的基因表達的影響，通過DE seq軟件對read count標準化，再根據負二項分布P模型計算得出假設檢驗概率(P)，最后進行多重假設檢驗校正，得到錯誤發現率(false discovery rate，FDR)值，以P<0.05作為篩選的差異表達基因的標準，若差異基因log2fold change>0，則該差異基因是上調，反之則下調。

本實驗一共篩選得到1 018個顯著性差異基因，509個顯著表達上調差異基因，509個顯著表達下調基因。因此，饑餓脅迫可引起魏斯氏菌代謝過程中基因的顯著變化。了解魏斯氏菌在饑餓脅迫下的轉錄組差異，對更好的利用乳酸菌具有實際的指導意義。

2.4.2 魏斯氏菌10d-17差異基因GO富集

使用軟件GO seq對差異基因進行GO基因功能國際標準分類體系注釋后,將基因和蛋白質功能進行限定和描述分為分子功能、生物過程和細胞組成3個部分。本研究挑選了富集最顯著的30個GO term，得到了饑餓處理后與正常狀態下的差異基因GO富集柱狀圖。如圖2所示，最顯著的30個GO term中，有14個term與RNA的活動相關，并且沒有term涉及細胞組成。由此可見，魏斯氏菌的生命活動與RNA的活動息息相關，主要通過調整與轉錄、翻譯相關基因的表達來調控蛋白，從而提高環境適應性，而營養限制對魏斯氏菌細胞組成方面的影響不大。

GO功能注釋分析結果顯示，在篩選得到的1 018 個顯著性差異基因中，有772個基因獲得GO功能注釋信息，其中上調基因有380個，下調基因有392個。有667個基因至少能關聯到MF的1個GO功能條目，有309個基因至少能關聯到CC的1個GO功能條目，以及639個基因至少能關聯到BP的1個GO功能條目。生物過程二級分類中基因數目最多的類別是RNA代謝過程，該分類包括了167個差異表達基因，其中96個上調基因，61個下調基因，生物過程二級分類中基因數目最多的類別是藥物結合，包含了146個差異表達基因，其中90個上調基因，56個下調基因。富集于藥物結合的差異基因大多數與ATP結合盒式蛋白(ATP-binding cassette，ABC)轉運系統和氨酰-tRNA的合成有關，RNA代謝過程的差異基因與氨酰-tRNA的合成有關。ABC轉運是實現物質跨膜運輸的重要途徑，能夠將發酵液中的無機離子、單糖等物質運輸至細胞內。全營養狀態下，細胞生命活動活躍，物質轉運加快。氨酰tRNA是一種與之對應的氨基酸相結合的tRNA(也被稱作“轉移核糖核酸”)。它能夠將氨基酸傳遞到核糖體中，并且把氨基酸加入正在延伸中的多肽鏈。氨酰-tRNA的合成收到氨酰-tRNA合成酶的調控，每1個氨酰-tRNA合成酶可識別一個特定的氨基酸與此氨基酸對應的tRNA的特定部位。與組氨酸、頡氨酸、蘇氨酸等16種氨基酸合成相應氨酰-tRNA的酶的調控基因均表達上調。這可能是因為在全營養狀態下，魏斯氏菌生長和繁殖速度加快，需要更多的蛋白質來支持它生長，而該菌可以通過調控氨酰-tRNA合成酶的表達來加速蛋白質的合成。

2.4.3 KEGG通路富集分析

KEGG是系統分析基因功能、基因組信息的數據庫，通過KEGG通路富集和注釋能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑[21]。魏斯氏菌共有290個差異基因被注釋到了43條通路，上調基因158個，下調基因132個。其中富集差異基因數量較多的通路為：生物化學代謝富集了132個差異基因，次生代謝物的生物合成富集了51個差異基因，微生物在不同環境中的代謝富集了40個差異基因，ABC轉運蛋白富集了31個差異基因。

2.4.4 魏斯氏菌10d-17糖酵解和丙酮酸代謝途徑差異基因表達分析

如表3所示，通過對2種不同狀態魏斯氏菌差異基因的分析發現，差異倍數大的基因集中于糖代謝和丙酮酸代謝途徑中，故選取這2個代謝途徑繪制通路圖進行分析。如圖3所示，糖酵解通路共注釋到20個差異基因，其中5個顯著性差異基因。葡萄糖發生酵解的第1步就是葡萄糖分子在己糖激酶和鎂離子的作用下發生磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。該菌的葡萄糖-6-磷酸主要有2種去向：(1)是進入磷酸戊糖途徑，磷酸戊糖途徑中的相關酶的表達呈現上調趨勢，從而促進PRPP的生成，為嘌呤核苷酸的合成提供重要的中間產物；(2)是在葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸異構酶生成果糖-6-磷酸，葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸異構酶編碼基因有上調趨勢，可能是因為底物濃度增加以后，高濃度的果糖-6-磷酸加速了果糖-2，6-二磷酸的合成，該化合物又進一步激活了果糖磷酸激酶的活性。果糖-1，6-二磷酸生成三磷酸甘油醛及后續代謝途徑相關編碼基因表達均下調或無明顯差異。

表3 魏斯氏菌10d-17丙酮酸代謝顯著差異基因表Table 3 Gene table of phosphotransferase system difference of Weissella 10d-17

丙酮酸代謝通路共注釋到13個差異基因，其中8個顯著性差異基因，丙酮酸核心代謝通路相關基因表達量均顯著下調，差異倍數為2～16。該菌的丙酮酸主要有3個去向：(1)在蘋果酸脫氫酶的作用下合成蘋果酸；(2)在乳酸脫氫酶的作用下合成乳酸；(3)變為乙酰輔酶A進入丁酸代謝。但是該菌未注釋到合成蘋果酸和合成乳酸的后續相關基因，蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的相關基因表達量差異不顯著。丙酮酸脫氫酶的編碼基因變化最為顯著，在饑餓條件下，分別上調了15.1、11.9、7.5倍，說明丙酮酸脫氫酶可能是該魏斯氏菌能量代謝中的關鍵酶，且在饑餓狀態具有對抗脅迫意義。丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，E1)編碼基因分別下調了15.1、11.9、7.5倍。可能還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和乙酰-輔酶A這2種產物的累積使二氫硫鋅酰轉乙酰基酶(dihydrolipoyl transacetylase，E2)停留在與乙酰基結合的形式，不能接受在E1酶上與焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)結合的乙酰基，從而抑制了丙酮酸脫羧作用。

3 結論與討論

本研究為揭示饑餓脅迫對魏斯氏菌代謝的影響，對魏斯氏菌的轉錄組進行測序和分析。結果顯示,每一組高通量測序獲得的原始測序數據量都在1.7 GB以上，其中Q20均在98.36%以上，高質量reads數在983萬～1 359萬條。鑒別出個顯著性1 018差異表達基因，其中實驗組中有509個基因表達上調，509個基因表達下調。對這些差異表達基因進行GO功能注釋和通路富集分析，結果發現，有772個基因獲得GO功能注釋信息，主要富集于RNA代謝過程和藥物結合。這些差異表達基因在KEGG生物通路中，以生物化學代謝、次生代謝物的生物合成等代謝途徑富集顯著。并且差異倍數較大的基因都富集于糖酵解和丙酮酸代謝通路。丙酮酸代謝途徑共注釋到8個顯著差異基因。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下轉化生成乙酰輔酶A，進入丁酸代謝，它的核心代謝通路相關基因表達量均顯著下調。

在面臨饑餓脅迫時，細胞繁殖生長速度減慢，與蛋白質合成相關氨酰-tRNA合成酶表達下調。為了維持基本的能量供給，該菌提高了糖酵解和丙酮酸代謝相關酶的表達。魏斯氏菌作為乳酸菌的一種，在產胞外多糖、抗炎癥、促進乳桿菌生長等益生作用方面顯示出一定的優勢，具有極高的生產和應用價值。并且近年來高通量測序技術的不斷發展，轉錄組學研究已經廣泛地應用于乳酸菌研究領域，并且成為研究乳酸菌的一項重要技術手段。但是目前對魏斯氏菌轉錄組相關研究還比較少。這株魏斯氏菌來源于傳統發酵辣椒，了解魏斯氏菌在面臨饑餓脅迫時的響應機制，為研究乳酸菌脅迫應答機制及其工業化應用提供新思路。