云貴高原典型湖濱濕地好氧甲烷氧化細菌群落結構和數量的時空動態

夏品華,林 陶

貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室, 貴陽 550001

甲烷(CH4)是大氣中僅次于CO2的第二大溫室氣體,對全球溫室效應的貢獻率達30%—40%[1]。CH4在大氣中的濃度已經從工業化以前的體數分數為7.15×10-6增長到現在的體數分數為1.77×10-5。大氣中增加的CH4主要來自人類的生產活動和自然生態系統釋放[2]。湖泊生態系統是大氣CH4的重要源,貢獻了自然排放總量的16%[3]。通常情況下,厭氧土層產甲烷菌產生的CH4約30%—90%在釋放到大氣之前被甲烷氧化菌(Methanotrophs)消耗掉[4-5],甲烷氧化菌以CH4作為唯一碳源和能源,在環境中起著CH4生物過濾器的作用[6-7]。

環境中存在兩類截然不同的甲烷氧化菌,好氧甲烷氧化細菌(methane-oxidizing bacteria,MOB)和厭氧MOB。其中,好氧MOB是甲基營養細菌(Methylotrophic bacteria)的一個分支[8],它們屬于變形菌門、疣微菌門和NC10門[9]。好氧MOB的生理和多樣性已經得到了很好研究[10]。目前自然濕地中僅發現變形菌門的分布,可分為Ⅰ型和Ⅱ型[11],其中Ⅰ型屬于γ-變形菌綱的甲基球菌科,現已發現了15個屬,Ⅱ型屬于α-變形菌綱,包括Methylocystaceae和Beijerinckiaceae 兩個科,前者有Methylocystis和Methylosinus屬,后者有Methylocapsa、Methylocella和Methyloferula屬[12]。通常以甲烷氧化單加氧酶功能基因(pmoA)為生物標志物,結合RFLP、測序等技術,對湖泊、沼澤等各種環境中好氧MOB群落組成進行了大量卓有成效的研究[13-15]。

湖濱濕地是湖泊生態系統重要組成部分,是湖泊CH4排放的熱區[16-17]。湖濱濕地急劇變化的水文、植被和土壤理化[18,19]對好氧MOB群落數量和組成、結構勢必會產生深刻的影響,進而影響CH4的產生、氧化、傳輸和排放,致使湖濱濕地CH4排放呈現高度的時空異質性。然而,對高原湖泊湖濱帶的關注較少,以往的研究大多集中在開放水域[20-22]。湖濱濕地沉積物好氧MOB群落與環境因素之間的聯系仍然不清楚,云貴高原湖濱濕地好氧MOB群落組成及分布鮮見報道。

云貴高原湖泊資源豐富,是我國三大高原濕地之一。雖然云貴高原湖泊沉積物中好氧MOB 的分布最近幾年已有少量報道[13,22],但尚不清楚湖濱濕地沉積物的好氧MOB群落如何隨季節和環境變化而變化。該研究的主要目的是揭示湖濱帶好氧MOB群落時空動態及其與環境的關系。本文以云貴高原湖泊濕地的典型代表——草海為研究對象,以pmoA為標記物,運用q-PCR、T-RFLP、和基因文庫構建等方法對貴州草海湖濱帶好氧MOB數量和群落結構進行了研究,分析了驅動好氧MOB群落時空動態的關鍵因子,研究結果豐富了人們對高原湖濱濕地好氧MOB群落生態學的認識。

1 材料與方法

1.1 樣點描述與采樣

貴州草海國家級自然保護區位于貴州省威寧彝族回族苗族自治縣縣城西南側,地處云貴高原烏蒙山區腹地[23]。其地理坐標介于26°47′35″—26°52′10″N和104°9′23″—104°20′10″E之間。海拔2171.7 m,屬亞熱帶高原季風氣候,冬暖夏涼、冬干夏濕的氣候特征,年均氣溫10.6 ℃,年均降水量950.9 mm,相對濕度79%。最深處為5 m。物種豐富,水生維管束植物68種,共記錄鳥類246種[24]。

根據草海湖濱濕地水文和植被分布格局,從湖濱寬敞水域至湖岸設置了四個采樣梯度,即長期淹水寬敞水域區沉水植被眼子菜(P)濕地(104°15.255′E,26°50.899′N)、長期淹水淺水區挺水植被水蔥(E)濕地(104°15.910′E,26°50.697′N)、干濕過渡區藨草(T)濕地(104°16.504′E,26°50.610′N)和偶爾積水區燈芯草(V)濕地(104°16.805′E,26°50.451′N),分別在2月、5月、7月和11月進行采樣,設置3—4個重復,分0—10 cm、10—20 cm和20—30 cm三層,記錄水深、溫度、植被高度等；土壤低溫保存帶回實驗室后,一部分風干測定理化指標,土壤理化指標參照《土壤農業化學分析方法》測定。另一部分置于-80℃冰箱用于好氧MOB分子分析。

1.2 DNA提取與pmoA基因擴增及純化

采用土壤DNA提取試劑盒(Bio 101 Inc., Calif., USA),取0.5 g土壤鮮樣,按照說明書步驟進行操作。DNA含量用NanoDrop? ND-1000核酸定量儀(Nanodrop technologies)測定,在-80 ℃貯存。采用好氧MOB的特異性引物A189f (5′-GGN GAC TGG GAC TTC TGG-3′)和mb661r(5′-CCG GMG CAA CGT CYT TACC-3′)[16]。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；接著35個擴增循環：94℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min。擴增的PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒Agarose Gel DNA Purification kit (Promega,USA),按說明書進行pmoA基因的回收純化。

1.3 實時熒光定量

pmoA基因定量分析引物同上,反應體系為10 μL,包括1μL DNA 模板、5 μL SYBR Premix Ex TaqTM,上、下游引物各0.1 μL (20 μmol/L) 和3.8 μL的滅菌雙蒸水,擴增條件同上。標準曲線相關系數R2為0.999,滿足絕對定量要求。

1.4 pmoA基因克隆文庫構建及RFLP分析

純化后的pmoA基因片段按說明書的方法與pMD 18-Tvector(Takara,Japan)連接。16 ℃過夜連接后,轉化入E.coli DHS感受態細胞。轉化產物涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固體培養基上,37 ℃下培養24 h,通過藍白斑篩選方法篩選重組子。挑取白色陽性轉化子構建克隆文庫,克隆文庫用LB(Amp+)平板4 ℃保藏,測序由北京六合華大基因公司進行,測序引物為載體通用引物T7。

為檢查整個克隆文庫的有效性,在所構建的各個克隆文庫中隨機挑取100個白色克隆子進行菌落PCR驗證。按照廠家說明書的方法對陽性克隆的PCR產物進行MspI(Takara,Japan)酶切。酶切消化產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段。用ABI3730遺傳分析儀中進行毛細管電泳；取熒光強度50RFU為基線,用Genemapper軟件(Version 3.7 Applied Biosystems Incorporated,USA)計算大于基線的峰高和出峰處的T-RF(末端標記限制性片段)長度。將T-RF介于50 bp和550 bp之間的峰面積進行標準化處理,計算相對應的豐度。

1.5 基因的序列分析和系統發育樹的構建

將克隆對應的每一個pmoA基因序列與GenBank數據庫中己知序列進行BLAST比較,鑒定與克隆序列親緣關系最近的種屬。并從數據庫中獲取相關的pmoA基因序列,采用Clustal X1.83軟件進行多重比對,用MEGA 6軟件包中的Neighbor-Joining法,設自展值為1000次,構建系統發育樹[25]。

1.6 數據處理與分析

PCoA、相關性及蒙特卡洛檢驗用R(3.5)進行分析,制圖軟件采用Origin 9.0。

2 結果

2.1 水文、植被和土壤特征

表1 環境因子

2.2 pmoA功能基因數量的時空分布

草海湖濱濕地好氧MOBpmoA功能基因數量豐富,在1.78×107—2.73×108拷貝數/g干沉積物之間(圖1),具有明顯的時空異質性。寬敞水域深水區和干濕交替區高,而淺水區和偶爾積水區低；在0—30 cm垂直剖面上,干濕交替區具有明顯的從表層至底層逐漸減低外,其它無明顯變化規律和趨勢。季節變化明顯,大小依次為7月>5月>11月>2月。pmoA功能基因數量與溫度極顯著正相關(P<0.01),與其它因子如水深、NO3-N等相關性不顯著(P>0.05)。

圖1 pmoA基因時空分布特征Fig.1 Spatio-temporal distribution of pmoA gene abundanceP: 眼子菜濕地Potamogeton；V: 燈芯草濕地Validus；T: 藨草濕地Triqueter；E: 水蔥濕地Effusus

2.3 酶切片段T-RFs的分布及甲烷氧化細菌鑒定

采用T-RFLP方法,對4種水位梯度下好氧MOB群落進行分析,共檢測到10個T-RFs(圖2)。在10個T-RFs中以75 bp、241 bp、243 bp和348 bp為主,其中75 bp的T-RFs主要分布在寬敞水域眼子菜濕地和淺水區水蔥濕地,隨著水位的降低而減少(P<0.01),與之相反,241 bp和348 bp的T-RFs主要分布在干濕交替區藨草濕地和偶爾集水區燈芯草濕地,隨著水位的降低而升高； 243 bp的T-RFs在不同水位梯度都有分布,且比較均勻；不過一些T-RFs對水文條件具有強烈的選擇性,如59 bp、140 bp和188 bp的T-RFs只分布在寬敞水域眼子菜和淺水區水蔥濕地,而234 bp的T-RFs只分布在干濕交替區藨草濕地和偶爾集水區燈芯草濕地。這表明草海湖濱濕地好氧MOB群落組成具有空間異質性。

圖2 pomA T-RFs相對數量Fig.2 Relative abundanc of pmoA T-RFs

選擇具有不同T-RF片段的沉積物樣品構建克隆文庫,進行測序分析,構建系統發育樹。 該序列在系統發育上與I型和II型相關(圖3)。I型好氧MOB屬于γ-變形菌綱的Methylococcaceae 科,II屬于α-變形菌綱的Methylocystaceae。75 bp的T-RF片段代表Methylococcaceae (Methylococcus,Methylocaldum)。241 bp的T-RF 片段代表Methylocystacea (MethylocystisandMethylosinus),2413 bp的T-RF片段代表Methylocystacea (Methylosinus)。

圖3 pmoA基因序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of pmoA gene sequences

2.4 好氧MOB群落時空動態

好氧MOB的主坐標分析結果見圖4。草海湖濱濕地4個水位梯度的31個樣品可以聚為4類,表明不同水位梯度下好氧MOB群落組成不同。基本上是深水區樣品聚為一組,而淺水區組成另一組,干濕交替區和偶爾積水區的樣品也各自成簇,但也存在一些交叉,如深水區的MP10與淺水區的聚在一組,干濕交替區JT20與落干區的聚為一組,呈現出明顯的過渡性分布特征。此外,我們還發現在季節上卻不能很好地進行分組,好氧MOB群落組成的分布不隨季節變化而改變。表明草海湖濱濕地好氧MOB具有顯著的空間變化。好氧MOB群落與環境因子的相關性分析和蒙特卡洛檢驗見圖5。pH是最主要的環境因子,其次是含水量(SWC)和溶解性有機碳(DOC),水深的影響也很顯著,但溫度、硝態氮和二價鐵的影響不顯著。

圖4 好氧MOB群落的主坐標分析(PCoA)Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) for MOBF：2月；M：5月；J：7月；N：11月

圖5 好氧MOB群落與環境因子的相關性及蒙特卡洛檢驗Fig.5 Correlations between MOB community and environmental factors and montel testWL:水深；SWC：土壤含水量；ST：土壤溫度；DOC：可溶性有機碳

3 討論

高原湖泊濕地是我國濕地重要組成,主要分布在青藏高原、云貴高原和蒙新高原等高原區,是我國甲烷排放的重要源[26]。湖濱濕地是湖泊生態系統的重要組成部分,是湖泊甲烷排放的熱區[16]。以往研究表明高原湖濱濕地甲烷排放具有高度的時空異質性,但關于高原湖濱濕地好氧MOB群落組成及其時空動態缺乏了解。本文采用實時熒光定量PCR和克隆測序,以云貴高原典型湖濱濕地草海為代表,研究了4種不同水文條件下沉積物中好氧MOB豐度和群落組成時空動態。研究結果對了解湖濱濕地甲烷溫室氣體排放的微生物作用機制具有重要意義。

3.1 好氧MOB數量與群落組成的時空動態

沉積物中好氧MOB數量的研究已有許多報道,但目前對不同區域不同類型濕地沉積物中的數量分布格局了解不夠。本研究中草海湖濱濕地pmoA功能基因數量在1.78×107—2.73×108拷貝數/g干沉積物之間,與我國青藏高原若爾蓋濕地(107—108拷貝數/g干沉積物)[27,28]以及云貴高原的其它濕地如拉市海、海西湖、長橋湖、天池等近10個湖泊濕地[22]相似；但略低于我國三江平原濕地(108—109拷貝數/g干沉積物)[29],以及云貴高原部分淺水和富營養化的湖泊,如劍湖濕地1.67×1010和普者黑濕地3.05×109[22]；高于北方湖泊(boreal lake)岸邊帶濕地105[20]和滇池沉積物104—107拷貝數/g干沉積物[15]和日本琵琶湖沉積物中MOP數量(8.8×106—5.8×107)[30]。高原湖泊較高的好氧MOB數量與其相當高的甲烷量有關[13],因為好氧MOB的生長依靠甲烷提供碳源和能源。

草海湖濱濕地沉積物中好氧MOB數量具有明顯的時空異質性。這與以往的一些研究一致,滇池沉積物中好氧MOB數量在(8.71×104—2.07×107)之間變化[13]；然而,Rahalkar[14]對Constance 湖的研究表明,沉積物中好氧MOB數量在空間上沒有差異(2.07×107—4×107)。本研究中從寬敞水域至偶爾積水區沿著水位的降低好氧MOB數量先降低后增加再降低的波浪式分布,其在淺水區最低,干濕交替區最高。干濕交替區由于干濕交替營造了好氧缺氧環境,為好氧MOB生提供適宜生長條件。季節上呈現出春夏季節高于秋冬季節的趨勢,這可能是由于春夏季節較高的溫度更適宜于好氧MOB生長的緣故。湖濱濕地沉積物中好氧MOB數量變化可能是其甲烷通量高度時空異質性的一個重要成因。

湖泊沉積物中好氧MOB群落具有明顯的時空異質性[20,21,32]。本研究也證實了這一點,草海湖濱濕地沿著水位梯度的變化好氧MOB群落組成和結構顯著不同,從寬敞水域至偶爾積水區甲烷菌由type I 好氧MOB向 type II 好氧MOB演替。寬敞水域深水區和淺水區沉積物中type I和type II好氧MOB都有分布,其中寬敞水域深水區中type I型methanotrophs (Methylococcus,Methylocaldum)主導,而淺水區沉積物中type I和type II好氧MOB數量相當。這與以往的研究結果一致,長期積水濕地環境中,I型好氧MOB通常超過II型好氧MOB[13,20]。Constance 湖沉積物中I 型好氧MOB是II型的4倍[14]。與II型好氧MOB相比,I型好氧MOB通常對CH4的親和力較低[28],且在CH4較高的地方具有較強的競爭優勢[13]。寬敞水域深水區沉積物中有機質、氮等營養物質豐富,且其厭氧環境有利于CH4的產生,這為低甲烷親和力的I型好氧MOB提供了物質保障。因此,淹水和富營養環境的沉積物中,就形成I型好氧MOB為優勢的分布格局。

干濕交替區藨草濕地和偶爾集水區燈芯草濕地好氧MOB群落由II 好氧MOB (Methylocystis,MethylosinusandMethylosinus)主導。在干旱環境中Type II 好氧MOB能很好生長并常常占據主導地位[28]。可以從以下兩個方面解釋較干環境利于II 型好氧MOB。首先,II 型好氧MOB對CH4的親和力比I型好氧MOB高[31]。另一個原因是II 型好氧MOB是K生活對策[33],忍耐干旱環境能力比I型好氧MOB強。II型好氧MOB,例如甲基胞囊菌屬,可以形成抗旱的囊胞[34],可以在不利的條件下長期生存[38]。因此,II型好氧MOB在湖濱濕地相對干旱的區域就形成了優勢。

湖濱濕地不同水位梯度下好氧MOB群落組成明顯不同,暗示湖濱濕地不同水位梯度下CH4的氧化可能由不同類型的好氧MOB主導。He等人[36]采用同位素探針技術,證明了湖泊沉積物中甲烷的氧化主要由I型好氧MOB驅動。據此推測,好氧MOB群落空間分布差異可能是導致湖濱濕地較高的甲烷排放及其高度的時空異質性一個重要原因。

3.2 好氧MOB群落時空變化的影響因素

湖濱濕地具有各種不同水文條件,沉積物質量,植物群落,CH4氧化率和好氧MOB群落。然而,主導湖濱濕地好氧MOB群落分布的因素仍不清楚。本研究發現草海湖濱濕地從寬敞水域至湖岸隨著水位降低type I群落向type II演替,這與湖濱濕地高度異質環境條件密切相關。

水文條件是驅動湖濱濕地好氧MOB群落空間分布的根本動力。水深梯度一方面可以直接影響好氧MOB群落分布。水深梯度控制了氧和CH4的可利用性,進而影響好氧MOB群落組成及活性空間分布[20]。長期積水的樣點有利于CH4的產生,從而增加了底物的利用率并維持好氧MOB活性。因此,長期積水的樣點形成較高的CH4氧化速率,較高的I型好氧MOB物種多樣性和豐富度。此外,水深梯度還可以改變沉積物的理化,進而間接的影響著好氧MOB群落。土壤理化特性如pH值等對土壤好氧MOB群落分布具有重要的調控作用。本研究中從寬敞水域至湖岸隨著水位降低沉積物pH值逐漸增大。有證據表明,高pH值有利于一般細菌物種的豐富性和CH4的氧化潛力[37]。本研究中沉積物pH在長期積水的樣點最低,可能對好氧MOB群落分布產生了影響。沉積物中的氮對好氧MOB群落也有重要影響。水深梯度還可通過調控植物群落的分布來影響著好氧MOB群落的分布。地上植被對地下微生物多樣性具有重要影響。淹水濕地植物通過向根際傳輸氧而對好氧MOB群落產生特殊影響。草海湖濱濕地植被分布受到水位嚴格控制,從寬敞水域至偶爾積水區,植被從沉水-挺水-濕生-中生演替,呈明顯的帶狀性,植被的這種變化在草海湖濱濕地好氧MOB群落時空分布動態中可能起到了重要的調控作用。

4 結論

本研究發現云貴高原草海湖濱濕地好氧MOB群落在數量和組成上表現出巨大的時空變化。草海濕地好氧MOB屬于變形菌門(proteobacteria),Ⅰ型和Ⅱ型都有分布,沿著水位降低Ⅰ型好氧MOB數量逐漸降低,而Ⅱ型好氧MOB數量逐漸增加,不同水位梯度下主導甲烷氧化的菌群可能不同。水文條件是決定湖濱濕地好氧MOB群落時空異質性重要因素,其直接或通過調控沉積物中理化和植物群落來影響好氧MOB群落的時空分布。下一步還需深入研究湖濱濕地中I型和Ⅱ型好氧MOB群落在甲烷氧化中的作用,并明確沉積物pH及植物群落對草海湖濱濕地好氧MOB群落分布的調控機制。