城市污水中菌群檢測方法的比較

車逍宇

（調(diào)兵山信環(huán)水務(wù)有限公司，遼寧調(diào)兵山 112700）

糞大腸菌群屬于大腸菌群的一類，將其作為衛(wèi)生學(xué)的指標(biāo)，代表性更突出。目前，糞大腸菌群被認(rèn)為是水體受糞便污染的最實用的指標(biāo)菌。如果水體中含有腸道病原菌株，飲用后會引起嚴(yán)重疾病，如泌尿系感染、菌血癥和腦膜炎，少數(shù)腸道病原菌株可引起急性腹瀉。采用科學(xué)的、準(zhǔn)確的、精準(zhǔn)的糞大腸菌群檢查方法，有助于全面監(jiān)控水域糞大腸菌群的污染情況，為預(yù)防與控制疾病的傳播與發(fā)展起到積極的指導(dǎo)作用。2021年5月31日，取調(diào)兵山污水廠的出水水樣至菌采樣袋中，放入經(jīng)過消毒的采樣桶。

1 糞大腸菌群的檢測方法

1.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法利用大腸菌群可以產(chǎn)酸及產(chǎn)生氣體的原理，發(fā)酵乳糖，引起紫色的乳糖蛋白胨蛋白液的顏色發(fā)生變化，小玻璃導(dǎo)管內(nèi)產(chǎn)生氣泡。

（1）初發(fā)酵試驗。

在裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中接入水樣，溫度控制在（37±0.5）℃，培養(yǎng)（24±2）h，如果發(fā)酵管中出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，說明結(jié)果為陽性。發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)氣情況不顯著，通過輕輕拍打試管，查看是否有小氣泡，有氣泡則為陽性，反之為陰性。

（2）復(fù)發(fā)酵試驗。

輕輕搖蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管，采用滅菌棒或接種環(huán)，將其轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液。在溫度（44.5±0.5）℃條件下，繼續(xù)培養(yǎng)（24±2）h。接種后，全部發(fā)酵管放入水浴鍋中水浴，時間控制在30 min。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察培養(yǎng)管，若有氣體產(chǎn)生，則可以確定為陽性結(jié)果。

根據(jù)接種量確定的陽性結(jié)果數(shù)量，通過MNP表查詢對應(yīng)的指數(shù)數(shù)據(jù)，將MPN值乘以10，即為1 L水樣中的糞大腸菌群數(shù)。

1.2 濾膜法

采用0.45 μm孔徑的微孔濾膜對水樣進(jìn)行過濾處理，濾膜吸附細(xì)菌，將濾膜轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對生長出的大腸菌群菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

（1）過濾水樣。

采用無菌鑷子從滅菌濾膜的邊緣位置處夾起，光滑面朝下貼放到濾床上，并將濾器固定；在濾器中注入適量的水樣，蓋上蓋子啟動真空泵，開始除菌抽濾。

（2）培養(yǎng)。

過濾完水樣繼續(xù)抽5 s再關(guān)閉真空泵，將濾器取下，用滅菌后的鑷子從菌濾膜邊緣部分夾起，轉(zhuǎn)移到M-FC培養(yǎng)基上，截留細(xì)菌一面朝上放置，濾膜和培養(yǎng)基應(yīng)貼合緊密。將平皿蓋好，倒放入恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)（24±2）h，培養(yǎng)溫度設(shè)置為（44.5±0.5）℃。

計數(shù)及報告結(jié)果：采用放大鏡或直接肉眼查看典型菌落數(shù)，在M－FC培養(yǎng)基上生長的糞大腸桿菌均為藍(lán)綠色或者藍(lán)色；其他菌種為無色、灰色或淡黃色。計數(shù)典型糞大腸菌群數(shù)，并計算出每升水樣中的數(shù)量。

1.3 紙片快速法

（1）概念。

紙片快速法以膠片、紙片及紙膜作為培養(yǎng)基載體，載體上附著特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)，糞大腸桿菌群生長在上面，顯示出對應(yīng)的顏色，由此判定菌群的數(shù)量；在紙片培養(yǎng)基上，糞大腸菌顯示為紅色，周邊會出現(xiàn)黃圈，這是由于糞大腸菌分解乳糖產(chǎn)生了酸類位置，引起指示劑發(fā)生變色反應(yīng)。

（2）檢測方法。

每份預(yù)監(jiān)測水樣接種水樣總量為55.5 mL，分別接種5張大紙片，每張接種10 mL水樣；接種10張小紙片，5張小紙片每張各接種1 mL。

將1 mL的1∶10稀釋水樣接種到另外5張小紙片上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，溫度控制在（44.5±1）℃；依照陽性紙片數(shù)量，查MNP表，得出最終的結(jié)果。

1.4 酶底物法

（1）概念。

酶底物法分析水樣中的糞大腸菌群數(shù)的原理是依據(jù)其可以產(chǎn)生β—半乳糖苷酶，分解P鄰硝基苯—β—D—半乳派喃糖，導(dǎo)致培養(yǎng)液呈現(xiàn)為黃色。

（2）檢測方法。

酶底物法以MPN法為基礎(chǔ)，采用51孔定量的方式。采用100 mL的無菌稀釋瓶量取樣，再加入Colilert試劑，搖晃均勻直到完全溶解，將水樣全部轉(zhuǎn)移到5l孔無菌定量盤中，程控定量封口機(jī)Sealer封口處放置定量盤。

培養(yǎng)24 h，溫度控制在44.5 ℃。孔穴內(nèi)的水樣變?yōu)辄S色，說明其中有大腸菌群，通過查表可以得到代表的糞大腸菌群數(shù)。

2 常見檢測方法比較

目前，常用于檢測糞大腸菌群的方法有兩種，分別為多管發(fā)酵法和濾膜法。其缺點是步驟較多、時間長、干擾因素較多且需要確認(rèn)試驗；只能分析少量的樣品，無法快速評價水的衛(wèi)生學(xué)狀況。

傳統(tǒng)方法的優(yōu)點在于原理簡單、費(fèi)用低、易推廣，因此在常規(guī)監(jiān)控中經(jīng)常使用傳統(tǒng)方法。

國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測定紙片快速法》（HJ 755—2015）（簡稱“紙片法”）和酶底物法，整個檢測周期只需要18～24 h，結(jié)果穩(wěn)定可靠、易于操作，且不需要確認(rèn)試驗。濾膜法還能夠評價水中大腸埃希菌、大腸桿菌的污染情況。

目前世界各國常采用的檢測方法如表1所示。

表1 糞大腸菌群各檢測方法的比較

3 結(jié)語

現(xiàn)階段，已有分子生物學(xué)方法用于檢測大腸菌群，其具有準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點。隨著檢測技術(shù)水平的不斷提高，其應(yīng)用的普及度主要受到技術(shù)操作難易程度、檢測設(shè)備、檢測成本、環(huán)境等多個方面的影響。為全面普及分子檢測方法，還需要通過長期的驗證與探索，不斷改進(jìn)與優(yōu)化，以提高技術(shù)的精準(zhǔn)性，實現(xiàn)技術(shù)的全面推廣。紙片法、酶底法兩種檢測方法的優(yōu)點在于檢測周期短、易于操作等，其會逐步替代傳統(tǒng)的濾膜法和多管發(fā)酵法，其中酶底物法應(yīng)用了密封培養(yǎng)等手段，能夠有效規(guī)避病菌感染檢測人員的問題出現(xiàn)。酶底物法應(yīng)用價值更高，未來在評價水質(zhì)微生物方面，可將其作為一種標(biāo)準(zhǔn)的、快速的檢測方法。未來監(jiān)控工作將會朝著自動化檢測的方向發(fā)展，一些新方法、新儀器也會得到應(yīng)用與推廣。