基于GEO數據挖掘與網絡藥理學探討化痰通絡湯治療腦梗死的機制研究

龔翠蘭 周德生 楊仁義 傅馨瑩

摘要 目的：采用GEO芯片數據及網絡藥理學方法，分析腦梗死疾病基因，并對化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證的作用機制進行探討，為腦梗死的中醫藥防治提供理論依據。方法：采用多學科交叉方法對化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證進行研究，整合GEO、GeneCards、TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt數據庫資源，利用Cytoscape、R語言軟件，對腦梗死差異基因、疾病靶點、化痰通絡湯的中藥有效成分、中藥靶點進行篩選，從蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）共表達網絡、GO及KEGG富集分析角度，探討化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證的所用機制。結果：獲取3 110個腦梗死疾病靶點，其中203個差異基因，198個在腦梗死疾病中表達上調，5個在腦梗死疾病中表達下調，可作為診斷及治療的潛在靶點。PPI網絡及Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析結果顯示，PI3KCA、MAPK1、EGFR等48個靶點相互作用最強，可作為后續基礎研究驗證方向。GO、KEGG富集分析結果顯示，BP共富集354個生物進程，CC共富集16個細胞組分，MF共富集29個分子功能，KEGG共富集137個信號通路，結合FDR、ratio與P值結果對富集分析結果進行權重分析，進一步聚焦其富集結果。結論：化痰通絡湯可針對性上調GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等，下調NAT8F3、OLR59、GPR88等，以多組分、多功能、多途徑的形式介導鞘脂信號通路、VEGF通路、HIF-1通路等多通路在腦梗死風痰阻絡證中發揮作用。

關鍵詞 基因表達綜合;差異基因;化痰通絡湯;腦梗死;網絡藥理學;風痰阻絡證;KEGG富集分析;靶點

Study on the Mechanism of Huatan Tongluo Decoction in the Treatment of Cerebral Infarction Based on GEO Data Mining and Network Pharmacology

GONG Cuilan1，ZHOU Desheng2，YANG Renyi3，FU Xinying3

（1 The Changde Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changde 451000，China; 2 The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China; 3 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To analyze the disease genes of cerebral infarction by GEO chip data and network pharmacology methods，and to explore the mechanism of Huatan Tongluo Decoction in the treatment of cerebral infarction with the syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals，so as to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cerebral infarction with traditional Chinese medicine（TCM）.Methods：Interdisciplinary methods were used to study the treatment of Huatan Tongluo Decoction for syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals of cerebral infarction.The database resources of GEO，GeneCards，TCMSP，PubChem，Swiss Target Prediction，String and WebGestalt were integrated，and the differential genes of cerebral infarction，disease targets，effective components and targets of Huatan Tongluo Decoction were screened by Cytoscape and R language software.From the point of view of PPI co-expression network，GO and KEGG enrichment analysis，the mechanism of Huatan Tongluo Decoction in treating cerebral infarction with syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals was explored tentatively.Results：A total of 3 110 targets of for cerebral infarction diseases were obtained， of which there were 203 differential genes. There were 198 up-regulated in cerebral infarction diseases， and there were 5 down-regulated in cerebral infarction diseases， which can be used as potential targets for diagnosis and treatment.The topology analysis results of PPI network，Degree，Betweenness，and Closeness algorithms showed that 48 targets such as PI3KCA，MAPK1 and EGFR interacted most strongly，which can be used as the direction of follow-up basic research.The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that BP enriched 354 life processes，CC enriched 16 cell components，MF enriched 29 Molecular functions，and KEGG enriched 137 signal pathways.Combined with the results of FDR，ratio and P value，the weight analysis results were analyzed to further focus on the enrichment results.Conclusion：Huatan Tongluo Decoction could up-regulate/down-regulate target genes（up-regulated GFAP，CD14，STAT3，H19，CXCL16，etc. and down-regulate NAT8F3，OLR59，GPR88，etc.）in the form of multi-component，multi-function and multi-pathway，mediate sphingolipid signal pathway，VEGF pathway，HIF-1 pathway and other pathways were playing a roles in the syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals in cerebral infarction.

Keywords Gene Expression Omnibus; Differential gene; Huatan Tongluo Decoction; Cerebral infarction; Network pharmacology; Syndrome of wind phlegm obstructing collaterals; KEGG enrichment analysis; Target

中圖分類號：R255.2;R743.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.010

腦梗死屬中醫“缺血中風”范疇，是臨床常見病、多發病，具有高致殘率、致死率的特點，嚴重危害人類健康，因此腦梗死的中醫藥防治具有重要意義[1]。《中國腦梗死中西醫結合診治指南（2017）》指出[2]，腦梗死中經絡期風痰阻絡證者，以突發半身不遂、偏身麻木、痰多而黏，脈弦等癥狀為主要表現，以熄風化痰、活血通絡之法，方用化痰通絡湯治之。本研究整合GEO芯片數據，結合網絡藥理學模式，探討腦梗死疾病潛在靶點，并對治療缺血中風風痰阻絡證的化痰通絡湯進行初步的機制分析，為中醫藥防治腦梗死提供理論和實踐依據[3]。

1 材料與方法

1.1 腦梗死疾病靶點篩選 利用基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Cerebral infarction”為檢索詞，獲取GSE97537數據集，下載MCAO與Sham組芯片數據，即MCAO組（GSM2571735、GSM2571736、GSM2571737、GSM2571738、GSM2571739、GSM2571740、GSM2571741）共7組;Sham組（GSM2571742、GSM2571743、GSM2571744、GSM2571745、GSM2571746）共5組。

采用R語言對下載的GSE97537數據集表達矩陣進行質量控制，繪制箱式圖及主成分分析圖;采用limma包對表達矩陣進行差異性分析，logFC≥1與adj.P.Val<0.05為差異基因篩選條件，以篩選出腦梗死疾病差異基因，并繪制火山圖與前50位熱圖。同時整合通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫中“Cerebral infarction”為檢索詞的腦梗死疾病相關靶點，與腦梗死疾病差異基因取并集，得到腦梗死疾病靶點。

1.2 化痰通絡湯潛在藥物靶點篩選 化痰通絡湯有效成分及結構式收集：1）采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫[4]，以藥代動力學ADMT參數中，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，藥物類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件[5]，獲取茯苓、半夏、白術、天麻、天南星、天竺黃、丹參、香附、大黃、三七10味中藥有效成分。2）采用PubChem[6]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫收集各有效成分SDF結構式。

化痰通絡湯潛在藥物靶點收集：采用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫[7]，將有效成分結構式導入數據庫，獲取化痰通絡湯潛在藥物靶點。

1.3 共同靶點篩選及蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網絡構建 將1.1中的腦梗死疾病靶點（簡稱：疾病靶點）與1.2中化痰通絡湯潛在藥物靶點（簡稱：藥物靶點）利用EXCEL取交集，并繪制韋恩圖，獲取化痰通絡湯治療腦梗死的共同靶點。

利用String[8]（https：//string-db.org/）數據庫，將共同靶點導入數據庫，獲取PPI相關信息。利用Cytoscape軟件對PPI信息進行網絡可視化，并對PPI網絡進行Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析。對PPI網絡Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析的靶點進行整合，采用EXCEL去除重復值保留唯一值，以獲取拓撲分析靶點。

1.4 拓撲分析靶點GO和KEGG富集分析 利用WebGestalt[9]（http：//www.webgestalt.org/#）數據庫，采用ORA算法，將拓撲分析靶點導入，進行GO、KEGG富集分析，收集生物進程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG富集分析數據，同時進行權重分析，并繪制火山圖。

2 結果

2.1 腦梗死疾病靶點篩選結果 利用GEO數據庫，獲取GSE97537數據集，采用R語言affyPLM與limma包對GSE97537進行歸一化與差異分析，并繪制數據歸一化箱數圖（圖1A）、GSE97537各組主成分分析圖（PCA，圖1B）、差異基因火山圖（圖1C）及前50位差異基因熱圖（圖1D）。歸一化及PCA結果顯示GSE97537數據集中各數據處于同一數量級，可進行綜合分析。火山圖及熱圖結果中，篩選出腦梗死疾病差異基因共203個，其中198個差異基因在腦梗死疾病中表達上調（如CCL2、HSPB1、HSPA1A等）;5個差異基因在腦梗死疾病中表達下調（如NAT8F3、GPR88、SYNDIG1L等）。

為進一步補充腦梗死疾病靶點，檢索并整合GeneCards數據庫中腦梗死疾病相關靶點，共檢索出腦梗死疾病相關靶點3 110個，并與腦梗死疾病差異基因取并集，去除重復值保留唯一值后，最終獲得腦梗死疾病靶點3 218個，其中有95個（圖2A）為GEO數據挖掘的腦梗死差異基因與GeneCards數據庫中腦梗死疾病相關靶點的重復靶點（如IL6、IL1B、FGF2等）。

2.2 化痰通絡湯潛在藥物靶點篩選結果 利用TCMSP數據庫，根據OB≥30%，DL≥0.18為初篩條件，獲取10味中藥有效成分，其中茯苓15個（如pachymic acid、trametenolic acid、ergosta-7，22E-dien-3beta-ol等）;半夏13個（如24-Ethylcholest-4-en-3-one、Cavidine、baicalein等）;白術7個（如12-senecioyl-2E，8E，10E-atractylentriol、α-Amyrin、3β-acetoxyatractylone等）;天麻21個（如Vanillin、Succinic Acid、Gastrodamine等）;天南星7個（如8，11，14-Docosatrienoic acid，methyl ester、24-epicampesterol、beta-sitosterol等）;天竺黃無;丹參65個（如6-o-syringyl-8-o-acetyl shanzhiside methyl ester、Baicalin、digallate等）;香附18個（如Chryseriol、isorhamnetin、8-Isopentenyl-kaempferol等）;大黃16個[如：Toralactone、aloe-emodin、（-）-catechin等];三七8個（如Mandenol、Stigmasterol、ginsenoside f2等）。采用PubChem數據庫收集上述有效成分SDF結構式。

利用Swiss Target Prediction數據庫預測化痰通絡湯潛在藥物靶點，去除重復值保留唯一值后，共獲取824個化痰通絡湯藥物潛在靶點（如PTGES、VEGFA、STAT1等）。

2.3 共同靶點篩選結果及PPI網絡構建 將3 218個腦梗死疾病靶點與824個化痰通絡湯藥物靶點利用EXCEL取交集，并繪制韋恩圖（圖2A），獲取化痰通絡湯治療腦梗死的共同靶點共463個（如STAT3、IL6、JUN等）。

將463個共同靶點導入String數據庫，獲取PPI相關信息，利用Cytoscape軟件對PPI信息進行網絡可視化（圖2B），并對PPI網絡進行Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析，并進行可視化（圖2C、D、E）。PPI網絡中，有463個節點，4 322條邊，P<1.0e-16，其中大紅色為50≤Degree≤84;藍色為30≤Degree值<50;粉紅色為1≤Degree值<30，選取PPI網絡中前30位的Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析結果。見表1。將PPI網絡Degree、Betweenness、Closeness算法拓撲分析的前30位靶點進行整合，獲得拓撲分析靶點共48個（如PI3KCA、MAPK1、EGFR等），可作為后續重點實驗驗證對象。

2.4 拓撲分析靶點GO和KEGG富集分析 BP共富集354個生物進程，結合FDR、ratio與P值結果權重分析，并繪制火山圖（圖3A），主要富集于促進細胞運動、循環系統過程、免疫應答調節途徑、二價無機陽離子穩態、肽蘇氨酸修飾與脂質代謝過程的調節等生物進程。

CC共富集16個細胞組分，結合FDR、ratio與P值結果權重分析，并繪制火山圖（圖3B），主要富集于膜區、囊泡腔、谷氨酸能突觸、富含ficolin-1的顆粒、膜面、軸突部分、膜的外在成分等細胞組分。

MF共富集29個細胞功能，結合FDR、ratio與P值結果權重分析，并繪制火山圖（圖3C），主要富集于G蛋白偶聯受體結合、磷脂酰肌醇雙磷酸激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等細胞功能。

KEGG共富集137個信號通路，結合FDR、ratio與P值結果權重分析，并繪制火山圖（圖3D），主要富集于鞘脂信號通路、VEGF信號通路、C型凝集素受體信號通路、神經營養蛋白信號通路、cAMP信號通路、HIF-1信號通路、TRP通道的炎癥介質調節通路。

3 討論

腦梗死具有高致殘率、高死亡率的特點，是常見病、多發病。腦梗死屬“缺血中風”，病因不外乎風、火、痰、瘀、虛、氣、血六端，病機總屬本虛標實，以氣血虧虛、肝腎陰虛為本，風火痰瘀為標[10]。中風風痰阻絡之證，肝脾腎虛，精微氣血不足或運化無力，聚濕成痰，痰濕內停，瘀血內生，痰瘀阻滯腦絡，發為中風，治療上當以熄風化痰、活血通絡之化痰通絡湯治之。隨著高通量測序及計算機算法的發展，基于芯片數據及網絡藥理學的方法，初步探討化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證的作用機制，為實驗研究提供方向，為臨床研究提供理論基礎，為中醫藥防治腦梗死提供實踐依據。

本研究利用GEO、GeneCards數據庫篩選出腦梗死差異基因與疾病基因，為腦梗死的診斷及防治提供了精準靶點;同時利用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction數據庫篩選出化痰通絡湯有效成分及其治療靶點，為化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證提供了靶點依據;最后對疾病靶點與中藥靶點綜合分析，篩選出化痰通絡湯治療腦梗死風痰阻絡證的可能靶點，并采用String、WebGestalt數據庫對靶點進行PPI網絡分析和GO、KEGG富集分析，為進一步明確作用機制提供了理論方向。

本研究通過GEO數據庫共篩選出203個腦梗死差異基因，其中CCL2、HSPB1、GSPB1、GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等198個基因表達上調;NAT8F3、OLR59、GPR88、PAMR1、SYNDIG1L 5個基因表達下調;GeneCards數據庫共篩選3 110個腦梗死相關靶點，涵蓋IL6[11]、GFAP[12]、TNF[13]、IL1B[14]、JUN[15]等95個差異基因，其中有大部分被文獻報道，在腦梗死疾病中異常表達，可作為腦梗死診斷治療的潛在靶點。Li等[11]研究發現鳶尾素可降低腦梗死小鼠TNF-1α、IL-6水平，抑制IL-1β的活化，激活Akt/ERK1信號通路，減少缺血區神經元損傷;團隊前期發現活血榮絡方下調JAK2、STAT3表達，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷炎癥反應，對神經元起到保護作用[16]。因此基于GEO、GeneCards數據庫篩選的腦梗死疾病基因，可作為腦梗死診斷、精準治療的靶點基因，為臨床及機制研究提供了理論依據。

中風之風痰阻絡證者，偏食肥甘醇酒之類，脾失鍵運，濕痰內生;或逸多勞少，形體肥重，痰濕氣虛，痰濕聚集，肝陽化風，風痰夾濕，阻滯脈絡，上擾清竅，則見眩暈頭疼、手足麻木、半身不遂、口角歪斜等癥，當以化痰通絡湯加減治之。化痰通絡湯[17]以化痰逐瘀、祛風通絡為治法，由茯苓、半夏、生白術、天麻、天南星、天竺黃、丹參、香附、大黃、三七等組成，其中，半夏燥濕化痰，香附理氣和中，二者為君藥合用，增強燥濕化痰之力，體現治痰先理氣，氣順則痰消之意;天南星、天竺黃清熱化痰，既助半夏化痰，又熄風定驚;大黃通腑瀉熱、涼血逐瘀，使腑氣暢通而痰火得以清化;丹參、三七行氣、活血化瘀，此四味共為臣藥;天麻熄風定眩，為佐藥;生白術、茯苓健脾利濕，健脾以杜生痰之源，利濕以助化痰之力，為使藥。綜合全方，溫涼兼進，共奏化痰祛瘀、熄風通絡之良效。為進一步探討化痰通絡湯在腦梗死中醫藥防治中的作用機制，本研究采用網絡藥理學的方法，利用TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt數據庫，獲取化痰通絡湯各中藥有效成分、結構式及824個藥物潛在靶點;同時對化痰通絡湯治療腦梗死的共同靶點進行PPI共表達網絡分析，其中PIK3CA、PIK3R1、APP、MAPK1、STAT3、VEGFA、MMP、AKT等PPI效果顯著，在化痰通絡湯治療腦梗死中發揮重要作用。研究發現化痰通絡湯能上調腦梗死患者血清VEGF水平，改善神經功能[18];也能抑制腦梗死大鼠MMP9的表達[19]，明顯改善大鼠神經功能。研究證實，有效成分黃芩素（Baicalein）能通過降低核因子κB的IκBα磷酸化與p65的核轉位，減少炎癥介質IL-6、IL-18釋放;還能降低LC3-Ⅱ/LC3-1比值，促進PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化，抑制自噬，從而減輕缺血再灌注大鼠神經炎癥、細胞自噬，對腦梗死損傷發揮神經保護作用[20]。因此化痰通絡湯及其有效成分可能主要通過PPI方式，以共表達網絡形式影響腦梗死疾病蛋白（如PI3K、VEGF、STAT3、MMP等）表達，從而發揮腦保護作用。

WebGestalt數據庫拓撲分析靶點GO、KEGG富集分析結果顯示，化痰通絡湯能多靶點、多成分、多途徑、多通路治療腦梗死疾病，主要在膜區、囊泡腔區，通過G蛋白偶聯受體結合、DNA轉錄因子模式，促進細胞運動、促進循環、促進免疫應答進程，介導鞘脂信號通路、VEGF通路、HIF-1通路發揮抗腦梗死疾病的作用。研究發現化痰通絡湯可激活VEGF通路，上調VEGF、CD31表達，從而促腦梗死后血管新生[21];香草醛（Vanillin）是化痰通絡湯有效成分，可通過G蛋白偶聯受體結合方式，在血腦屏障區，上調ZO-1、occludin、Claudin-5表達，阻斷MMP-9活化，減輕氧化應激和保持血腦屏障完整性，從而發揮腦保護作用[22]。

綜上所述，本研究整合多個數據庫資源，初步篩選出上調/下調差異基因，同時篩選出化痰通絡湯藥物的有效成分及治療靶點，最后通過共表達網絡及富集分析得出，化痰通絡湯可針對性上調/下調靶點基因（上調GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等，下調NAT8F3、OLR59、GPR88等），以多組分、多功能、多途徑的形式，介導鞘脂信號通路、VEGF通路、HIF-1通路等多通路在腦梗死風痰阻絡證中發揮作用，為該方的臨床進一步推廣應用及深入研究奠定了科學基礎。

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（2020-04-10收稿 責任編輯：芮莉莉）