蒙藥山沉香抗心肌缺血及其作用機制研究

張冬艷，陸景坤，張 燁，孫 鵬，張 烜，薛培鳳

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059；2.西安市第三醫院藥劑科）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌的急性壞死性損傷，在發達國家可能是導致死亡的主要原因[1]。據世界衛生組織（WHO）統計，每年約有1200萬人死于MI[2]。缺血性心臟病主要是由冠狀動脈循環改變引起的心肌缺血缺氧導致的[3]。當冠狀動脈供血或供氧不足，不能滿足心肌代謝的需要時，就會造成不可逆的心肌損傷[4]。雖然目前缺血性心臟病主要是以化學藥物或機械手段進行控制和治療，但傳統醫藥具有多成分、多靶點、療效多樣的特點，同樣被廣泛應用于心血管疾病的臨床治療[5]，并且在該領域顯示出廣闊的前景[6，7]。

蒙藥山沉香是一種蒙醫常用藥，為木樨科丁香屬植物羽葉丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）的根、莖和粗枝，又名賀蘭山丁香，蒙藥名阿拉善-阿嘎如[8]。山沉香有鎮赫依、清熱、止痛、平喘的功效[9]，主要用于治療胸悶氣短、心肌缺血等心肺疾病，多與其他蒙藥配伍使用[10]?，F代藥理研究主要集中于其抗心肌缺血作用[11-14]，有文獻報道山沉香揮發油[11]、醇提物均可改善大鼠（或小鼠）心肌缺血癥狀[12，13]，山沉香超微粉也可改善大鼠急性心肌缺血各項指標[14]。

本研究分別給予Wistar大鼠山沉香原粉、醇提物、揮發油、醇提物+揮發油，并采用ISO誘導急性心肌缺血的模型，初步評價山沉香對心肌缺血的治療作用、活性部位及其可能的作用機制，為該蒙藥作為抗心肌缺血藥物應用于臨床提供理論基礎和實驗支持。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材

山沉香藥材購自呼和浩特藥材總公司，經鑒定為羽葉丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）去皮的莖和枝干。

1.2 實驗試藥

異丙腎上腺素（上海邁瑞爾化學技術有限公司），蘇木精、伊紅（西力生物），總RNA提取試劑盒（澤生試劑耗材），Trizol試劑盒（TaKaRa公司），反轉錄試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3 實驗動物

健康Wistar雄性大鼠，體重（200±20）g，（動物許可證號SCXK（京）2006-0009，北京維通利華公司）。

1.4 儀器

BL-420F生物機能實驗系統多道生理記錄儀（成都泰盟軟件有限公司），FA1104電子分析天平（上海海康電子儀器廠），包埋機、石蠟切片機、攤片機、烘片機（德國Leica公司），光學顯微鏡（德國Leica公司，連接LAS V4.5圖像分析軟件），PCR儀（美國Applied Biosystems公司），臺式低溫離心機（德國EPPENDORF公司），恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠），電泳設備（美國BIO-RAD），凝膠成像系統（champGel 5000）。

2 方法

2.1 藥材制備

600g山沉香原藥材經粉碎機粉碎后，過80目篩，得山沉香原粉，等量分成3份，各200g。200g干燥山沉香藥材粗粉加入6倍量95%乙醇，加熱回流提取3次，每次2h，然后合并濾液，60℃水浴揮發至無醇味，將所得浸膏真空干燥至完全干燥，研磨成粉末后過80目篩，得山沉香醇提物粉37.04g。200g干燥山沉香藥材粗粉加入蒸餾水至沒過藥材，用揮發油提取器提取，得山沉香揮發油0.62g。

2.2 實驗分組及處理

65只大鼠隨機分為7組：空白對照組（10只），模型組（10只），陽性對照組（普萘洛爾10mg.kg-1，9只），山沉香原粉組（1.62g.kg-1，9只），山沉香醇提物組（0.3g.kg-1，9只），山沉香揮發油組（5.5mg.kg-1，9只），山沉香醇提物+揮發油組（劑量按1：1配比，9只），空白對照組和模型組灌胃同等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），山沉香原粉、醇提物及揮發油劑量按同等質量原粉中提取醇提物和揮發油克數折算所得。各組每日灌胃一次，連續灌胃9天。

2.3 造模方法

皮下注射ISO（85mg.kg-1）造成大鼠急性心肌缺血的模型[15]，除空白對照組外，其余各組均在第8天和第9天灌胃1h后，腹部皮下注射ISO（85mg.kg-1）。

2.4 心電圖監測

大鼠用5%水合氯醛麻醉后仰臥固定，用針電極鉗夾住四肢，采用標準肢體Ⅱ導聯連續進行心電監測。末次注射ISO（85mg.kg-1）后，實時監測大鼠體表肢導聯心電圖，持續動態觀察大鼠心電圖的變化，每只大鼠采集15min，采集圖像后觀察并比較各組心電圖變化差異。

2.5 心臟病理組織檢測

取各組大鼠心臟，生理鹽水沖洗至無血色，在10%福爾馬林液中固定48h以上后，采用HE染色法觀察心肌組織的病理變化情況。

2.6 心臟組織中Bax、Bcl-2的表達

將心臟組織在研缽中磨碎，每50～100mg組織加1ml裂解液，按照Trizol試劑盒和總RNA提取試劑盒的操作方法，提取各組大鼠心肌組織總RNA，設計引物后，利用反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，最后進行PCR擴增。

選用GAPDH作為內參基因，引物序列分別為：GAPDH上游引物序列5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3'，下游引物序列5'-CACAAACATGGGGGCATCAGCGG-3；Bax上游引物序列5'-CCAGGACGCATCCACCAAGAA-3'，下游引物序列5'-AGTGTCCAGCCCATGATGGTTC-3'；Bcl-2上游引物序列5'-CCCCTGGCATCTTCTCCTTC-3'，下游引物序列5'-CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC-3'。

反轉錄反應溫度條件為37℃15min，85℃5s，溫度降至4℃后取出，其產物cDNA于-20℃保存備用。PCR反應溫度條件為94℃5min初變性，然后94℃30s，56℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，共完成35個循環。對擴增后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外條件下，采集凝膠圖像，Image J軟件對圖像進行灰度值分析。

2.7 統計方法

各組大鼠心電圖監測結果采用SPSS20.0軟件進行分析，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。采用SPSS 20.0軟件對各組大鼠Bcl-2/Bax灰度值比值進行分析，采用t檢驗，檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 山沉香對大鼠急性心肌缺血心電圖的影響

實驗結果見表1。各組大鼠典型心電圖見圖1。與空白對照組比較，其他各組S-T段均有所抬高。模型組大鼠心電圖表現出明顯波形改變，S-T段異常抬高；各給藥組與模型組比較，急性心肌缺血心電圖表現均有所改善。以心電異常率為指標，結果顯示：醇提物組與模型組相比，心電異常率經卡方檢驗，χ2=2.686，P=0.005（P＜0.01）；醇提物+揮發油組、揮發油組心電異常率均為66.67%，兩組與模型組相比，χ2=0.465，P=0.303（P＞0.05）；原粉組與模型組相比，χ2=2.686，P=0.057（P＞0.05）。統計結果表明：與其他給藥組相比，山沉香醇提物對大鼠急性心肌缺血時S-T段的抬高具有更為明顯的治療作用，且與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），說明山沉香醇提物對ISO所致的大鼠急性心肌缺血治療作用最顯著。

圖1 各組大鼠典型心電圖Fig1 Typical ECGs in each group

表1 山沉香對大鼠急性心肌缺血心電圖的影響Tab.1 The effect of Syringa pinnatifolia on ECG of acute myocardial ischemia in rats

3.2 山沉香對急性心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

在400倍光學顯微鏡下觀察心肌組織HE染色切片，結果見圖2。由圖可見，空白對照組大鼠心肌細胞完整，排列整齊規則，橫紋及肌小節清晰可見。心肌細胞著色均勻，細胞核形態正常、無固縮，核內染色質分布均勻，細胞膜完整，細胞界限清晰（見圖2A）。模型組大鼠心臟組織心肌纖維損傷呈彌漫大片狀（見圖2B）。陽性對照組（普萘洛爾組）心肌細胞排列整齊規則，橫紋清晰。少有炎細胞浸潤，著色略不均勻，心肌纖維間隙稍大（見圖2C）。山沉香揮發油組大鼠心肌纖維間隙增大，部分區域著色不均勻，間質血管內有輕度出血（見圖2D）。醇提物組心肌缺血改善明顯，心肌細胞排列整齊規則，結構完整，橫紋清晰可辨（見圖2E）。原粉組病變較輕，胞質輕度水腫、深染，心肌纖維間隙較大（見圖2F）。醇提物+揮發油組大部分心肌細胞完整、無異常，著色輕度不均勻，心肌纖維間隙較大，少部分溶解斷裂（見圖2G）。

圖2 各組大鼠心肌組織典型病理變化（400×）Fig2 The typical pathological changes of myocardial tissue in each group（400×）

3.3 山沉香對缺血心臟組織中Bax、Bcl-2的表達變化的影響

實驗結果見圖3。陰性組僅加入輔助試劑，未加入各組大鼠心臟組織PCR產物或引物試劑，作為陰性對照。由圖可見，除陰性組外所有樣本中GAPDH均有表達，模型組Bcl-2表達較弱，醇提物組、醇提物+揮發油組Bax表達較弱。

圖3 Bax、Bcl-2及GAPDH的凝膠圖像Fig3 The gel images of Bax,Bcl-2 and GAPDH

對采集的凝膠圖像，采用Image J軟件對圖像進行灰度值分析后，計算Bcl-2/Bax比值。由圖4可見，除揮發油組外，山沉香其他各處理組Bcl-2/Bax比值顯著高于模型組（P＜0.05），其中醇提物組Bcl-2/Bax比值顯著高于其他組（P＜0.001）。

圖4 各組大鼠Bcl-2/Bax值比較Fig4 Comparison of Bcl-2/Bax values in each group

4 討論與結論

ISO是一種β腎上腺素受體激動劑，當大劑量的ISO注射到動物體內時，會引起類似于人類心肌缺血的癥狀，可導致心肌細胞能量耗竭和不可逆的細胞損傷。因此，利用ISO建立MI模型已被各種藥物研究所采用[16]，其劑量參照文獻選擇[15]。

心電圖的相關表現是診斷MI的重要標準。ST段抬高或壓低區別缺血或非缺血。在本研究中，我們發現了ISO組的大鼠心電圖ST段明顯升高，這可能與心肌缺血或壞死等因素有關[16]。山沉香各處理組成功地改善了ISO誘導的心電圖異常，說明山沉香對心肌缺血損傷具有保護作用。

HE染色是評估心肌損傷的重要方法[17]。組織病理學檢查進一步證實了心電圖監測的結果。我們發現心肌梗死的主要病理表現為損傷區域心肌纖維間隙增大，排列紊亂、扭曲，溶解斷裂，水腫明顯，橫紋不清甚至消失，間質血管內充血、出血，淋巴細胞浸潤等。山沉香各處理組治療后上述病理表現明顯改善。以上結果表明，山沉香能有效改善ISO誘導的心肌梗死。

大劑量的ISO也會導致活性氧的產生和抗氧化酶系統的喪失。氧化應激通過直接或間接的機制介導心肌細胞凋亡，導致心肌梗死[16]。Bcl-2蛋白家族被認為是調節細胞凋亡的關鍵因素。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白（Bax）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）[18]。本研究發現，山沉香各處理組Bcl-2/Bax比值顯著高于ISO模型組（P＜0.05），其中醇提物組Bcl-2/Bax比值顯著高于其他組（P＜0.001）。

本研究采用不同的方式對山沉香藥材進行處理，得到山沉香原粉、醇提物及揮發油，比較了各組對大鼠急性心肌缺血的治療作用，結果發現醇提物的作用最顯著，表明醇提物可能是山沉香治療心肌缺血的主要活性部位。但要具體到更小的活性部位或某些活性成分，還需要利用化學手段進一步去除無效或有害成分，結合更加廣泛的體內及體外試驗，才能逐漸明確。另外，實驗結果表明山沉香可能是通過上調抗凋亡因子（Bcl-2）和下調促凋亡蛋白（Bax）來保護心肌細胞，抑制細胞凋亡?？紤]到傳統醫藥多成分、多靶點的特點，山沉香也有可能通過其他炎癥或凋亡途徑發揮抗心肌缺血作用。因此，未來需要更多更深入的研究，才能更加明確山沉香抗心肌缺血的藥效物質基礎，完善其作用機制。