血漿骨粘連蛋白水平影響因素的研究

吳烏德勒胡，包 旭，齊金新，趙雅欣，李冬梅

（1.內蒙古自治區人民醫院內分泌科，內蒙古 呼和浩特 010017；2.內蒙古科技大學包頭醫學院；3.內蒙古醫科大學）

隨著經濟的發展，中國的城市化進程明顯加快，同時人口老齡化的加速等原因，我國糖尿病患病率仍在上升，最新調查結果顯示，18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%，其中以2型糖尿?。═2DM）為主，占90%以上。同時肥胖和超重人群糖尿病患病率顯著增加，從體重指數（BMI）方面調查顯示，25kg/m2≤BMI＜30kg/m2者糖尿病患病率為13.8%，BMI≥30kg/m2者糖尿病患病率為20.1%[1]。近年來，骨粘連蛋白（osteonectin，ON）引起大家的極大關注，它與糖尿病和肥胖密切相關。ON最初被發現于骨骼，也被稱為富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC），也被稱為BM-40。ON主要存在于細胞外基質，在胰島、脂肪組織、肝臟和骨骼肌等多個組織中均有表達，是一種由多種細胞分泌的多功能糖蛋白，它還參與骨生成、血管形成、傷口愈合、腫瘤、肝腎纖維化和抑制脂肪生成等過程[2，3]。最近研究發現，屬于糖代謝負調節因子的微小RNA-29（miR-29）家族通過抑制ON合成來抑制葡萄糖攝取，miR-29s/ON通路在糖代謝中起重要作用[4]。ON在ob/ob小鼠平滑肌組織中呈現高表達，可能參與了胰島素抵抗與糖尿病及其并發的動脈粥樣硬化的過程[5]。ON可增強骨骼肌AMPK依賴的葡萄糖攝取，可改善飲食誘導肥胖小鼠的糖耐量和胰島素抵抗，以及對改善代謝紊亂有重要作用[6]。ON基因敲除小鼠表現出糖代謝異常，隨著年齡的增長，脂肪組織的沉積也會增多，影響葡萄糖穩態[7]。較低的ON水平可能是健康肥胖的早期標志物[8]。肥胖者ON mRNA的表達高于非肥胖者，ON的表達受到脂肪含量、瘦素、血糖及胰島素水平的影響[2]。

但是，目前對于血漿ON水平影響因素方面的報道相對較少。ON是一種分泌蛋白，多項研究表明ON與糖脂代謝密切相關，本研究通過動物實驗和臨床觀察來探討血漿ON水平的影響因素以及分析其分泌特點，為ON可能成為糖尿病和肥胖的治療新靶點機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 基礎研究對象實驗采用雄性C57BL/6J小鼠，小鼠被安置在一個可控的環境中，自由飲水，并以高壓滅菌的CE-2飲食（CLEA日本）作為食物喂養。用血糖儀Freestyle Freedom（日本大阪，Nipro）測量血糖濃度。

1.1.2 臨床觀察對象收集自2018-11～2020-11于內蒙古自治區人民醫院內分泌科收治的2型糖尿病伴超重或肥胖病人36例，進行饅頭餐試驗。

1.2 方法

1.2.1 禁食試驗采用8周齡雄性C57BL/6J小鼠，禁食前和禁食24h后分別測定體重、血糖、胰島素和骨粘連蛋白水平。葡萄糖負荷試驗：采用6周齡雄性C57BL/6J小鼠，禁食6h后，經口給予葡萄糖（2g/kg體重）或PBS緩沖液，并在灌糖后0、15、30、120 min分別測定血糖、胰島素和骨粘連蛋白水平。胰島素負荷試驗：采用9周齡雄性C57BL/6J小鼠，腹腔注射人胰島素（Humarin，Eli Lilly，Kobe，日本）（1U/kg體重）或PBS緩沖液。給藥后0、20、40、60min分別測定血糖和骨粘連蛋白水平。

1.2.2 饅頭餐試驗選取36例T2DM伴超重或肥胖的患者，空腹狀態下進食150g饅頭，在餐前和餐后2h分別測定血糖、胰島素及骨粘連蛋白水平。

1.3 統計學分析

采用學生t檢驗，所有數據均以平均值±標準差表示。檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05說明組間差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 禁食試驗中骨粘連蛋白水平

在禁食試驗中，與禁食前相比較，禁食后的體重顯著下降[（23.64±1.13）g vs（19.93±0.92）g，P＜0.05]，血糖顯著降低[（95.5±14.25）mg/dL vs（63.64±6.31）mg/dL，P＜0.05]，胰島素水平顯著降低[（746.7±333.49）pg/mL vs（228.4±200.12）pg/mL，P＜0.05]。但是，血液中骨粘連蛋白水平無明顯變化[（262.08±82.38）ng/mL vs（215.47±66.67）ng/mL，P＞0.05]（見圖1）。

圖1 禁食試驗中骨粘連蛋白水平

2.2 葡萄糖負荷試驗中骨粘連蛋白水平推移

在葡萄糖負荷試驗中，與PBS緩沖液組小鼠相比較，葡萄糖負荷組小鼠的骨粘連蛋白水平無明顯差異（見圖2）。血糖變化：0min[（147.0±5.60）mg/dL vs（138.7±10.16）mg/dL，P＞0.05]，15min[（211.2±12.90）mg/dL vs（358.8±15.75）mg/dL，P＜0.05]，30min[（218.5±22.22）mg/dL vs（347.3±29.15）mg/dL，P＜0.05），60min[（214.2±28.60）mg/dL vs（308.3±58.06）mg/dL，P＜0.05]，120min[（186.2±15.85）mg/dL vs（227.0±23.67）mg/dL，P＜0.05]；胰島素變化：0min[（950.5±551.93）pg/mL vs（844.8±211.63）pg/mL，P＞0.05]，15min[（833.3±300.33）pg/mL vs（2080.9±474.01）pg/mL，P＜0.05]，30min[（849.0±323.72）pg/mL vs（1267.8±175.09）pg/mL，P＜0.05]，120min[（884.9±225.97）pg/mL vs（1015.4±193.94）pg/mL，P＞0.05]；骨粘連蛋白水平推移：0min[（106.1±40.52）ng/mL vs（115.5±23.34）ng/mL，P＞0.05]，15min[（122.5±31.73）ng/mL vs（122.6±24.74）ng/mL，P＞0.05]，30min[（119.8±29.70）ng/mL vs（115.7±19.07）ng/mL，P＞0.05]，120min[（105.5±29.09）ng/mL vs（116.5±23.72）ng/mL，P＞0.05]。

圖2 葡萄糖負荷試驗中骨粘連蛋白水平推移

2.3 胰島素負荷試驗中骨粘連蛋白水平推移

在胰島素負荷試驗中，與PBS緩沖液組小鼠相比較，胰島素負荷組小鼠的骨粘連蛋白水平無明顯差異（見圖3）。血糖變化：0min[（91.8±4.34）mg/dL vs（101.7±12.33）mg/dL，P＞0.05]，20min[（140.5±12.50）mg/dL vs（61.3±6.69）mg/dL，P＜0.05]，40min[（164.8±23.63）mg/dL vs（70.9±4.94）mg/dL，P＜0.05]，60min[（199.0±12.66）mg/dL vs（88.4±9.33）mg/dL，P＜0.05]；骨粘連蛋白水平推移：0min[（168.6±72.99）ng/mL vs（188.6±61.77）ng/mL，P＞0.05]，20min[（143.5±74.38）ng/mL vs（211.8±71.48）ng/mL，P＞0.05]，40min[（206.8±62.50）ng/mL vs（220.5±89.06）ng/mL，P＞0.05]，60min[（236.6±110.18）ng/mL vs（254.6±73.85）ng/mL，P＞0.05]。

圖3 胰島素負荷試驗中骨粘連蛋白水平

2.4 臨床觀察高碳水化合物刺激對骨粘連蛋白分泌水平的影響

在饅頭餐試驗中，比起餐前，餐后2h血糖顯著升高[（8.8±2.17）mmol/L vs（15.2±4.0）mmol/L，P＜0.05]，胰島素水平顯著升高[（11.0±7.19）uU/mL vs（45.6±30.49）uU/mL，P＜0.05]。但血液中骨粘連蛋白水平無明顯差異[（93.1±30.81）ng/mL vs（97.9±29.49）ng/mL，P＞0.05]（見圖4）。

圖4 饅頭餐試驗中骨粘連蛋白水平變化

3 討論

本研究通過動物實驗和臨床研究，在饑餓試驗、高糖及胰島素刺激下評估了血漿ON濃度變化，結果無論在小鼠還是在人體，刺激前后的血漿ON水平均未見明顯變化。有研究報道，急性極限運動刺激后，血清ON水平同樣沒有顯著變化，這與我們的研究結果是一致的[9]。

表1 2型糖尿病患者基本情況

ON與糖尿病以及胰島素分泌密切相關。鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠β細胞功能失調而胰島素的分泌減少，其ON在胰腺中表達顯著下調[10]。在人的胰島中觀察ON表達與葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）的關系，發現糖尿病患者ON的表達減低，ON的表達與GSIS呈正相關。此外，在人工培養的胰島β細胞（INS-1）中，ON的過度表達導致葡萄糖刺激下的胰島素分泌比對照細胞增加2.4倍。研究指出，ON的這種調節作用涉及WNT信號通路和參與β細胞變化的若干相關基因[11]。ON的缺乏降低了胰島β細胞胰島素的表達和葡萄糖刺激的胰島素分泌，這種情況在高脂飲食喂養的動物中更為顯著，ON是調節胰島素表達和分泌所必需的[7]。在β細胞中，G蛋白信號調節因子4（RGS4）通過調節M3受體G蛋白偶聯調節胰島素分泌，是已知的胰島素分泌的負調節因子，ON通過下調RGS4的表達來調節胰島素分泌[12]。ON在胰島素分泌和保持胰島β細胞功能上具有潛在的調節作用。

ON是一種分泌蛋白，分泌蛋白一般有兩種途徑從細胞中分泌，也就是調節型分泌途徑和組成型分泌途徑[13]。眾所周知，胰島素的分泌是通過調節型分泌途徑完成的，胰島素原從內質網移動到高爾基體區域，隨后不久被包裝成分泌顆粒，然后轉化為胰島素，在葡萄糖刺激下分泌到細胞外[14]。ON在細胞質合成后進入高爾基體，在信號肽的引導下分泌到細胞外。研究發現，胰腺基質細胞中ON的表達受胰島素和葡萄糖的調節[15]。胰島素和瘦素作用下可增加脂肪組織中ON的表達[2]。但我們的研究結果顯示，血漿ON水平在短時間內不受葡萄糖和胰島素刺激的影響。

綜上所述，ON參與調節胰島素分泌，其表達和分泌也受胰島素等代謝指標的影響，但血漿ON水平在短時間內不受代謝參數以及饑餓應激的影響，其分泌特點不同于胰島素分泌途徑，是以組成型分泌途徑分泌到細胞外。本研究在ON與糖尿病和肥胖相關機制研究提供科學依據。