STAT3-siRNA表達載體對肝癌細胞pim-2基因表達的影響

劉 洋，陳立軍，靳秋月，袁建龍

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.武警后勤學院衛生勤務系）

pim基因屬于絲氨酸/蘇氨酸細胞蛋白激酶（proviral integration site of murine）家族，對凋亡誘導通道進行有效的控制不僅可有效阻止染色體異常細胞凋亡，而且還能夠對細胞周期進行實時調控，一旦染色體分離會產生影響，導致失敗，同時還會呈現出多倍性，此時也就會出現惡性腫瘤[1～3]。本實驗通過STAT3-si RNA表達載體轉染肝癌SMMC-7721細胞株，研究STAT3-siRNA表達載體對更有助于對STAT3信號轉導通路進行研究，同時還便于分析下游pim-2基因的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

si LentGeneTM-2 U6 Hairpin Cloning System（Human）試劑盒在此次實驗中我們所選定的供應商為Promega公司、購自NEB公司的限制性內切酶EcoRⅤ、購自博奧申公司的質粒提取試劑盒、總RNA提取試劑在此次實驗中我們所選定的供應商為Invitrogen公司、RT-PCR試劑盒在此次實驗中我們所選定供應商為索來寶公司、購自Promega公司的CodeBreakerTMsiRNA脂質體轉染試劑、購自Santa Cruz公司的PIM-2單克隆抗體、購自博奧申公司的β-actin單克隆抗體、由大連寶生物公司合成的STAT3基因片段、由上海賽百盛公司合成的內參βactin引物和pim-2引物。

1.2 細胞培養

肝癌細胞株SMMC-7721放置在CO2培養箱內培養，5%CO2，37℃靜置培養，培養基為含10%的小牛血清RPMI-1640。

1.3 化學合成si RNA

從Genebank獲取人STAT3mRNA全序列（序列號：NM003150）。在RNA干擾設計原則的指導下，尋找干擾RNA的靶序列，該序列在對EST基因庫進行檢索時主要采用了BIast，這樣就可以保證是獨一無二的靶向基因，同時需要保證STAT3特異性的，對于其他基因的表達沒有任何的抑制，同時該部位也沒有任何的堿基多態性，1426-1444的核苷酸堿基序在此時也就可以確定TTGAATTCTGCAGAGAGGC，是RNA的干擾序列。按照promega公司siLentGeneTMU6盒RNA干擾系統的引物設計的原則，構建序列的下游引物。該下游引物囊括了5＇端磷酸基、局部EcoRⅤ序列、U6所對應的終止序列、靶序列所對應的反義互補序列、袢環以及靶序列形成回文莖環結構、U6盒配對序列，如下：5'-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCT TGAATTGAATTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCC TTTCCACAAGA-3'

1.4 重組載體si RNA的構建

使用試劑盒擴增系統擴增發夾結構，在T4 DNA連接酶作用下，將純化好的SECs與psiLentGeneTM載體置于4℃連接，此時需要一直過夜，向DH5α轉化，后續所展開的抗性篩選主要采用了Amp，基于平板來進行培養。陽性克隆提取DNA，用EcoRⅤ酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。成功篩選陽性重組質粒后，對其進行測序，psiLent GeneTM載體此時也就證明被插入目的DNA片段。

1.5 RT-PCR檢測pim-2 mRNA水平表達的變化

腫瘤組織總RNA的提取在此次實驗中主要采用了Trizol試劑，后續所進行的操作必須要嚴格的遵循RT-PCR試劑盒說明書。反應條件為94℃5min，94℃50s→55℃50s→72℃1min 35cycle，72℃8min。Pim-2引物序列為，sense：5'CATTCCCGTGGAGTTGTC3'；antisense：5'CATCCTCGGCTGGTGTTT3'；擴增產物長度為415bp。β-actin引物序列為，sense：5'GTGGACATCCGCAAAGAC3'；β-actin antisense：5'GAAAGGGTGT AACGCAAC；擴增產物長度在經過了測定后也就可以確定為302bp。基于1%瓊脂糖凝膠電泳，這樣也就可以實現對產物的擴增，接下來需要掃描，這一操作需要用到的設備為BIO-RAD圖象分析儀，能夠對結果數據進行詳細記錄。

1.6 檢測PIM-2蛋白表達水平的變化基于Western blot

基于腫瘤組織還需實施超聲破碎，在對腫瘤組織進行處理時首先要選取定量的蛋白上樣緩沖液，然后煮沸，充分的混合均勻，后續也就可以將其保存在-20OC的溫度條件下。之后是對SDS-PAGE分離膠和濃縮膠進行配制，濃度分別為10%和5%。對所保存樣品進行取樣，容量為20μL，之后進行90V恒壓電泳和20V恒壓電泳，時間分別設定為1h和2h。上述操作完成后進行凝膠提取，4℃、90V恒壓電轉1～2h。取出PVDF膜，加1：500稀釋的PIM-2一抗溶液，再在4℃環境中進行過液。之所以對所收取的進行微微振蕩其目的是為了更好的將反應液過濾，然后選擇PBS進行洗滌，次數為3次。最后是染色操作，可選用DAB染色試劑來進行，同時使用相機進行拍照。

1.7 統計學處理

對于實驗結果需進行統計學分析，可借助SPSS 11.0統計來實現。

2 結果

2.1 重組質粒載體的構建與鑒定

基于重組質粒需進行EcoR V酶切，然后與空載體酶進行對比分析。另外還需實施凝膠電泳，這樣酶切質粒，此時也就獲得了載體片段以及小片段，對應分子量為4000bp以及300bp。而空載體經酶切后只有一條約4000bp的載體片段。重組質粒是否構建成功可通過測序結果進行體現，同時還能夠判斷所插入的DNA序列是否正確。

圖1 重組質粒酶切鑒定圖

圖2 重組載體測序圖

2.2 RT-PCR檢測pim-2 mRNA表達

基于條帶亮度來實現對pim-2mRNA表達有效的判斷。實驗結果（見圖3），通過分析測試結果了解到空轉染試劑組（SMMC-7721）、空質粒組（SMMC-7721）、pim-2基因（SMMC-7721）變化并不明顯，基因表達量減少變化最大的當屬SMMC-7721 STAT3-SECs表達載體組pim-2基因。

圖3 STAT3-siRNA表達載體轉染SMMC-7721細胞后pim-2 mRNA水平

2.3 Western Blot檢測PIM-2蛋白表達

基于PIM-2蛋白的表達水平可借助Western Blot進行檢測，在34KD處標定特異條帶，選擇βactin作為基準，對PIM-2和β-actin顯色條帶進行灰度掃描，結果顯示其與β-actin表達一致，在這一環節中表達量變化程度最大的當屬PIM-2蛋白，而SMMC-7721空轉染試劑組、空質粒組PIM-2蛋白表達量并無實質變化。

圖4 STAT3-siRNA表達載體轉染SMMC-7721細胞后PIM-2蛋白表達水平

3 討論

越來越多的研究人員開始關注RNA干擾（RNA interference，RNAi）、小分子干擾RNA片段（small interfering RNA，siRNA）。RNA能夠使基因mRNA被雙鏈RNA分子敲除，表現要優于正義和反義RNAi[4，5]。RNAi最可實現對基因表達的調節或關閉。而siRNA即RNAi階段產生的小雙鏈RNA分子，大約擁有2l-25個核苷酸，屬于核心中間效應分子，當前siRNA已經被人工合成，可將mRNA有敲除[6]。si RNA在基因治療和基因功能研究中有著廣泛應用。

有關激活子和轉錄信號傳導子從本質上來講皆屬于STAT3重要的組成成員[7～9]。在家族基因分類上pim基因可歸屬到絲氨酸/蘇氨酸細胞蛋白激酶的范疇，其能夠更好促進細胞增殖[1～3]。在Pim激酶的表達調控中，STATs扮演著非常關鍵的角色，STAT3／STAT5在被活化后，其可以結合于ISFR／GAS序列，這在很大程度上可以上調pim-1基因表達[10，11]，受體酪氨酸激酶FLT3在白血病中能夠起到關鍵作用，同時還可以對pim-1基因進行表達。STATs根據研究顯示其顯著關聯著Pim-1激酶，受到后者的負反饋調節，Pim-1激酶使得SOCS1／SOCS3被磷酸化，讓SOCS1／SOCS3分子可以展現出更高的穩定性，對于STATs活性有間接抑制的作用[12]。通過對stat3和pim家族的關系分析了解到前者能夠對后者的表達進行調控，這不僅有利于對pim家族作用機制進行分析，而且還便于STAT3信號轉導通路作用的發揮。應用RNAi技術研究stat3對肝癌SMCC-7721腫瘤細胞中pim-2基因的影響還未見報道。

基于STAT3的研究是建立在前人實驗的基礎之上，同時再輔以RNAi技術，進而對人肝癌SMMC-7721細胞進行分析，研究過程中所選擇的靶點為STAT3第400～500位之間的氨基酸，并以此為基準進行構建表達載體，最后對pim-2基因表達的影響進行探究。通過分析可以看出，不管是mRNA水平，或者是細胞水平都表現出了pim-2基因的抑制作用。綜上所述不論是細胞水平還是蛋白水平都能夠在特定條件下發揮其功能優勢，能夠對pim-2基因的表達效果起到良好的抑制作用。基于腫瘤基因的臨床治療可借鑒細胞水平上RNAi，原因在于其能夠肝癌治療提供強有力的實驗基礎。有關體外腫瘤細胞基因的培養僅僅借助RNAi技術還存在一定的漏洞，仍需不斷對其進行完善，其切入點可選擇siRNA使用劑量和siRNA人體方式，通過不斷深入研究進而解決siRNA對人體所造成的副作用問題。有關轉染率的提高、使用什么方式對siRNA表達載體作用最多的時間、通過何種方法檢測其轉染效率、shRNA可以穩定進行表達與否、表達shRNA效率情況等，這些問題需要進行深入的分析研究。