舒馬普坦脂質體的處方與制備工藝優化

屈曉梅，強永在

（內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部，內蒙古 呼和浩特 010050）

舒馬普坦，化學名為3-（2-（二甲胺基）乙基）-N-甲基-1H-吲哚-5-甲烷磺酰胺，對5-HT1D受體具有高度選擇性，可收縮顱內血管，改善腦血流供應，因此常用作治療偏頭痛[1]。目前美國FDA批準的劑型有注射劑、片劑和鼻噴劑；國內上市銷售的為片劑和膠囊劑，舒馬普坦口服給藥雖然吸收迅速，但首過效應顯著，導致其生物利用度僅為14%[2]；舒馬普坦注射劑起效快，但注射部位反應、發熱、頭暈、惡心、嘔吐等副作用發生率較高[3]，影響其臨床應用。脂質體（liposome）是由卵磷脂和膽固醇制備而成的一種新劑型，具有雙分子層結構，性質類似于細胞膜，囊泡內腔可以包裹疏水性或親水性藥物，可以增加難溶性藥物的水溶性、提高藥物的穩定性，同時兼有良好的生物相容性、無免疫原性、增強靶向性等優點[4，5]。因此，為提高舒馬普坦的治療指數、降低不良反應發生率，本研究擬采用乙醇注入法制備舒馬普坦脂質體，在單因素考察的基礎上結合響應面分析法對制備工藝進行優化，并對包封率、載藥量、粒徑、Zeta電位等制劑學性質進行評價，為開發注射用舒馬普坦脂質體提供理論依據。同時通過本研究，豐富舒馬普坦臨床給藥手段，給患者提供更多、更便利的用藥選擇。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相色譜儀（美國沃特世公司），LC-500超聲波清洗儀（山東濟寧魯超超聲設備有限公司），2000型旋轉蒸發器（鄭州生化儀器有限公司），ZEN3690粒徑測定及ZETA電位儀（英國馬爾文公司）。

舒馬普坦(廣州雋沐生物科技有限公司，含量＞98%，批號JM－6430）；卵磷脂購自阿達瑪斯（純度＞98%，批號011008202）；膽固醇（艾偉拓醫藥科技有限公司，批號B61251）；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 舒馬普坦的UPLC測定方法

2.1.1 色譜條件[6]Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相為乙腈-水（25:75，醋酸調節pH5），流速0.3 mL/min，進樣量5μL，檢測波長228nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取舒馬普坦脂質體懸浮液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，0.22μm微孔濾膜過濾后，即得。

2.1.3 標準曲線的建立 精密稱取舒馬普坦對照品14.6 mg，甲醇溶解并定容至100 mL量瓶，作為對照品貯備液（濃度146μg/mL）。分別精密吸取該對照品貯備液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mL于10mL量瓶中，流動相定容，即得質量濃度分別為1.46、7.30、14.6、29.2、43.8、73.0μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為：Y=983.42X+564.2（r=0.9997），結果表明，舒馬普坦在質量濃度1.46-73.00μg/mL范圍內，峰面積與濃度之間線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 取質量濃度分別為7.30、29.2和73.0μg/mL的對照品溶液注入超高效液相色譜儀，分別連續進樣6次，記錄舒馬普坦峰面積，考察日內精密度，結果RSD分別為0.35%、0.54%和0.42%；另取質量濃度分別為7.30、29.2和73.0μg/mL的舒馬普坦溶液，連續測定3天，記錄峰面積，考察日間精密度，結果RSD分別為0.57%、0.64%和0.49%。舒馬普坦的日內和日間精密度均＜1%，表明精密度良好，滿足方法學驗證要求。

2.1.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h進樣5μL，測定舒馬普坦峰面積，計算RSD為1.17%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.1.6 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣5μL，測定舒馬普坦峰面積，計算RSD為0.65%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 回收率試驗 取同一批已知濃度的舒馬普坦脂質體供試品9份，分別加入相當于樣品含量80%、100%和120%的舒馬普坦對照品儲備液，進樣測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表1。結果舒馬普坦的平均回收率為98.71%，RSD為1.05%，表明方法準確度較高。

表1 舒馬普坦回收率試驗

2.2 舒馬普坦脂質體的制備[7]

采用乙醇注入法制備舒馬普坦脂質體，具體操作如下：精密稱取處方量的卵磷脂和膽醇，用適量無水乙醇溶解后，邊攪拌邊加入溶解舒馬普坦的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），水浴超聲30 min得白色混懸液；在40℃旋轉蒸發儀中去除有機溶劑，即得半透明帶有淡藍色乳光的脂質體懸浮液。

2.3 脂質體包封率及載藥量的測定[8]

采用超速離心法分離游離舒馬普坦和舒馬普坦脂質體。精密量取制備好的脂質體懸浮液1.0 mL，甲醇破乳并定容至5 mL量瓶，0.22μm微孔濾膜過濾后進樣測定，帶入回歸方程計算得到舒馬普坦濃度及藥物量（W總）；另取等量脂質體懸浮液，離心15 min（轉速為10000 rpm）濾過，續濾液進樣測定，帶入回歸方程計算得到游離舒馬普坦濃度及游離藥物量（W游離），計算包封率（%）=（W總-W游離）/W總×100%，載藥量=（W總-W游離）/M總×100%，M總表示脂質體總質量。

2.4 單因素試驗

2.4.1 卵磷脂/膽固醇質量比對脂質體包封率的影響 固定舒馬普坦/卵磷脂質量比為1:15，磷酸鹽緩沖液pH為6.6，水合時間為20 min，超聲時間為30 min，旋蒸溫度40℃；改變卵磷脂/膽固醇質量比（3:1、5:1、7:1、9:1、11:1）制備脂質體。測得包封率分別為46.21%、58.47%、50.18%、45.27%、41.68%。結果表明包封率隨著卵磷脂/膽固醇質量比增加，呈現先增加后降低的趨勢，當卵磷脂/膽固醇質量比5:1時，舒馬普坦脂質體的包封率最高。

2.4.2 藥物/卵磷脂質量比對脂質體包封率的影響固定卵磷脂/膽固醇質量比為5:1，其余條件同“2.4.1”，改變舒馬普坦/卵磷脂質量比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）制備舒馬普坦脂質體，測得包封率分別為52.18%、56.39%、59.94%、57.21%、55.38%。結果表明舒馬普坦/卵磷脂質量比1:15時，脂質體的包封率最高，比例過高或過低，包封率均下降。

2.4.3 超聲時間對包封率的影響 固定卵磷脂/膽固醇質量比為5:1，舒馬普坦/卵磷脂質量比為1:15，其余條件同“2.4.1”，超聲時間分別設置為10、20、30、40、50 min制備舒馬普坦脂質體。測得包封率分別為46.34%、53.66%、63.37%、59.26%、54.31%。結果表明，隨著超聲時間的延長，舒馬普坦脂質體包封率先增大后減小，超聲30 min最為適宜。

2.4.4 水合時間對包封率的影響 固定卵磷脂/膽固醇質量比為5:1，藥物/卵磷脂質量比為1:15，其余條件同“2.4.1”，水合時間分別設置為20、40、60、80、100 min制備舒馬普坦脂質體。測得包封率分別為62.29%、69.32%、65.17%、60.84%、58.59%。結果表明，40 min的水合時間最為適宜。

2.5 脂質體制備工藝優化

2.5.1 試驗設計及結果 根據單因素試驗結果，選取卵磷脂/膽固醇質量比(X1)，舒馬普坦/卵磷脂質量比(X2)，超聲時間(X3)和水合時間（X4）4個影響因素，以包封率（Y）為評價指標，采用Box-Behnken設計優化處方工藝，試驗設計及安排見表2。

表2 試驗因素及水平

2.5.2 模型擬合 實驗數據用Design Expert軟件處理，包括模型擬合及方差分析，得到回歸方程為：Y=-437.547+22.989X1+17.731X2+7.189X3+9.653X4+0.148X1X2+0.096X1X3+0.0637X1X4-0.1195X2X3-0.0035X2X4- 0.0138X3X4- 2.951X12- 0.0848X22-0.1083X32（R2=0.9615，P＜0.0001），表明擬合的模型具有顯著性；而失擬項P＞0.05，表明失擬項不顯著，綜上得出所擬合模型可準確預測實際情況。根據擬合結果，繪制3D效應面圖和2D等高線圖，分析影響舒馬普坦脂質體包封率的因素以及因素間的相互作用，綜合效應面、等高線圖及方差分析結果，可以發現X1、X3、X4、X2X3、X12、X22、X32、X42的P值均小于0.05，表明其對包封率影響顯著。利用Design Expert軟件，以包封率最大為指標，預測超聲法制備舒馬普坦脂質體的最優工藝為：卵磷脂/膽固醇質量比5.4:1，舒馬普坦/卵磷脂質量比1:14，超聲時間31 min，水合時間42 min，預測包封率為77.01%，按此處方工藝制備3批舒馬普坦脂質體，測得包封率分別為76.74%、77.19%和76.84%，平均值為76.91%，RSD為0.32%，與預測值較為接近，說明該模型準確可靠，可以用響應面法對舒馬普坦脂質體的處方及制備工藝進行優化。

2.6 脂質體載藥量、粒徑和Zeta電位的測定

取最優工藝下制備的舒馬普坦脂質體，測定計算其載藥量為8.42%（w/w）；另將舒馬普坦脂質體懸浮液稀釋一定比例，用馬爾文粒度分析儀測定，結果平均粒徑為（172.2±18.4）nm，多分散指數（PDI）為（0.216±0.003），Zeta電位為（-21.3±1.6）mV。

表3 試驗安排及結果

圖1 包封率與各因素間的3D效應面圖

3 討論

脂質體的制備方法有薄膜分散法[7，8]、乙醇注入法[9]、冷凍干燥法[10]和逆向蒸發法[11]等，預實驗中分別用以上幾種方法制備舒馬普坦脂質體，結果以乙醇注入法包封率最高，且具有操作簡便，材料環保等優點，因此確定舒馬普坦脂質體制備方法為乙醇注入法。脂質體包封率的常見測定方法有透析法[12]、高速離心法和葡聚糖凝膠小柱法等[13]，透析法需在透析袋內外游離舒馬普坦擴散達平衡后進行測定，這一過程需要10 h，等待時間較長。本試驗嘗試用自制葡聚糖凝膠小柱分離脂質體，結果葡聚糖凝膠對舒馬普坦保留率較低，不能將脂質體與游離藥物有效分離。高速離心法操作簡便，本研究發現高速離心15 min后脂質體可沉積于離心管底部，實現脂質體與游離藥物的有效分離，因此本試驗選擇超速離心法測定包封率。

確定了脂質體的制備方法和包封率的測定方法后，選擇卵磷脂/膽固醇質量比，舒馬普坦/卵磷脂質量比，超聲時間和水合時間4個因素進行單因素實驗，初步確定了最優值的范圍，在此基礎上進行了4因素3水平的Box-Behnken實驗設計，得到舒馬普坦脂質體的最佳制備工藝，驗證試驗表明此條件下制備的舒馬普坦脂質體包封率為（76.91±0.24）%，與預測值接近，說明預測的工藝合理可行。本方法制備的脂質體載藥量略低，可能與卵磷脂用量較高有關（舒馬普坦/卵磷脂為1:14），載藥量與文獻報道接近[14，15]。今后工作需從輔料選擇及制備工藝兩方面入手，通過考察選擇優良的高性能輔料，再經進一步的處方優化，制備出包封率與載藥量均高的脂質體。