青貯專用復合酶制劑調控苜蓿發酵品質及營養成分

李玉玉，牟怡曉，張 碩，馬聰慧，雷曉青，朱鴻福，張 歡，張桂杰

（1.寧夏大學農學院動物科學系，寧夏 銀川 750021；2.寧夏草牧業工程技術研究中心，寧夏銀川 750021；3.天津云力之星生物科技有限公司，天津 300354）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種優質高產的豆科牧草，其蛋白質含量高，且含有動物所需的多種礦物質和維生素，因其優良的飼用特性，被稱為“牧草之王”[1]。目前，我國苜蓿主要加工方式是干草制作，調制過程中苜蓿自然曬干較為困難，易發霉變質，且干草飼喂營養損失較大[2]。因此，將苜蓿制成青貯飼料，不僅可以延長貯存時間，還可以有效減少營養損失，提高其適口性和消化率。對于牧場來說，青貯苜蓿是可靠又經濟的蛋白質飼料，提升青貯飼料品質、提高青貯飼料用量是中小型牧場降本增效的有效措施之一。因而，越來越多從事苜蓿生產的企業開始關注苜蓿青貯的調制，青貯飼料的制備也趨于機械化和自動化[3]。在國家“振興奶業苜蓿發展行動”計劃支持下，寧夏大力發展苜蓿產業，建設高產優質苜蓿示范區，使得優質苜蓿種植面積不斷擴大。寧夏地區第2茬至第4茬(6月至8月)苜蓿收割期，正值雨熱同期，這為調制干草帶來了挑戰。隨著牧場對苜蓿青貯的認可度越來越高，寧夏苜蓿青貯生產空間巨大，可有效促進苜蓿產業和奶業的發展[4]。

由于紫花苜蓿刈割時水分含量較高，可溶性碳水化合物含量少，附著的乳酸菌較少，緩沖能較高，因此難以單獨青貯[5]。已有研究證實[6-10]，生物添加劑如乳酸桿菌和纖維素酶等可以有效改善青貯品質。其中，纖維素酶可以降解植物細胞壁，將多糖水解為單糖，增加青貯發酵底物，產生大量乳酸和少量乙酸，降低pH，提高發酵品質[11]；研究表明，纖維素酶能夠降低中性洗滌纖維濃度且對未成熟植株作用效果更強[12]；纖維素酶還可改善飼料青貯品質[13-14]。目前關于纖維素酶調控青貯品質的研究主要集中在單一纖維素酶對飼草青貯品質的影響[15-17]，為此，本研究選擇青貯專用復合纖維素酶，探究其對苜蓿青貯的營養成分、發酵品質、微生物數量及有氧穩定性的影響，為提高苜蓿青貯品質和拓寬草食家畜優質飼草料來源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗原料

試驗選用寧夏茂盛草業公司種植的“中苜4號”紫花苜蓿，于2018年5月19 日現蕾期–始花期刈割，留茬高度7 cm。刈割后，苜蓿陰干，由Aurora 型手持式近紅外光譜儀，確定水分含量下降至65%左右進行青貯。苜蓿營養成分含量分別為干物質37.40%，粗蛋白19.33%，粗脂肪1.90%，可溶性碳水化合物2.03%，中性洗滌纖維48.54%，酸性洗滌纖維37.32%，酸性洗滌木質素6.12%，纖維素31.33%，相對飼喂價值為114.65。

1.1.2試驗添加劑

試驗所用青貯復合纖維素酶由天津云力之星生物科技有限公司饋贈，是一種專用于苜蓿青貯的復合酶制劑，其中纖維素酶活力≥60 000 U·g?1，木聚糖酶活力≥ 2 500 U·g?1，淀粉酶活力≥ 300 000 U·g?1，β-葡聚糖酶活力≥300 000 U·g?1。

1.2 試驗設計

采用單因素完全隨機設計，對照組(T1組)不添加青貯專用復合纖維素酶，T2組、T3組、T4組分別添加2.5‰、5.0‰和7.5‰青貯專用復合纖維素酶，每個處理6個重復。苜蓿原料用鍘刀鍘成2 cm的小段，將纖維素酶均勻地拌于原料之中，裝于單向氣閥的青貯袋(20 cm ×30 cm)中進行真空壓縮密封，密封后密度為705～725 kg·m?3，室溫25℃，青貯時間60 d。

1.3 測定指標與方法

1.3.1營養成分

分別取適量液氮中苜蓿和500 g 青貯料置于凍干機中凍干，凍干后再次稱量，計算干物質(dry matter,DM)經粉碎機粉碎，過0.425 mm 孔徑篩，裝袋置干燥處保存。粗蛋白(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract,EE)、可 溶 性 碳 水 化 合 物(water soluble carbohydrate,WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)、酸性洗滌木質素(acid detergent lignin,ADL)、粗纖維(crude fiber,CF)含量參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[18]進行測定。相對飼喂價值(relative feed value,RFV)計算方法為：

1.3.2發酵品質

pH測定方式：稱取5 g 樣品于錐形瓶中，加入45 mL 蒸餾水，振蕩30 min，并使樣品完全浸入水中，用封口膜封口，于4℃下保存24 h，用4層紗布過濾取上清液，使用雷磁PHS-3G 精密pH 計進行測定。

氨態氮/總氮(NH3-N/TN)采用苯酚–次氯酸鈉比色法測定；乳酸(lactic acid,LA)使用試劑盒測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)的測定：取濾液0.5 mL，加入等體積的8.2%偏磷酸，13 000 r·min?1離心10 min，取上清液加入內標巴豆酸，使用GCMS-TQ8040型氣相色譜儀(日本島津公司)，Rtx?-Wax 毛細管色譜柱，分析測定上清液中丙酸、乙酸及丁酸的含量。

1.3.3微生物和有氧穩定性

乳酸菌、酵母菌、霉菌數量的測定使用稀釋涂布平板法，選用MRS 培養基培養乳酸菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基培養酵母菌和霉菌。乳酸菌選擇培養基上光滑、圓形的白色菌落進行計數，酵母菌計數選擇培養基上濕潤、光滑、不透明、大而厚的菌落進行計數。霉菌選擇為培養基上菌絲細長、菌落疏松呈絨毛狀面絮狀的菌落進行計數，菌落計數單位用lg cfu·g?1表示。

有氧穩定性的測定：在發酵60 d 后打開全部發酵袋青貯，將溫度記錄儀(HOBO Pendant Temperature/Light，USA)放入發酵袋幾何中心處，封口并在青貯袋上刺小孔，置于室溫(26℃)下保存，使空氣可以自由進入袋中。同時在室內不同位置放置3個溫度記錄儀。若青貯袋中的溫度高于室溫2℃，則說明青貯開始腐敗變質，計算開袋至腐敗變質的時間。

1.4 數據分析

使用Excel對數據預處理，再使用SPSS 23.0統計分析軟件進行ANOVA 方差分析比較均值，并采用Duncan’s法進行多重比較。P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯營養成分的影響

T2、T3和T4組CP含量均高于T1組，T4組的CP含量最高(表1)，顯著高于T1組(P<0.05)；各組間EE 無顯著性差異(P>0.05)；T3組WSC含量極顯著高于其他處理組(P<0.01)；纖維素酶處理青貯中CF含量極顯著低于T1組，且T3組極顯著低于T2組(P<0.01)；T3組NDF含量極顯著低于其他處理組(P<0.01)；T3組與T4組的ADF 含量與RFV值極顯著低于或高于T1組和T2組(P<0.01)；纖維素酶處理組ADL 含量極顯著高于T1組(P<0.01)，但處理組間差異不顯著(P>0.05)。

表1 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯營養成分的影響Table 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage nutrition components

2.2 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯發酵品質的影響

如表2所列，添加纖維素酶可極顯著降低青貯pH(P<0.01)，其中T2組最低，為4.43，酶處理組間差異不顯著(P>0.05)。纖維素酶處理組氨態氮含量極顯著低于T1組(P<0.01)。添加纖維素酶的3個處理組中，乳酸含量隨纖維素酶添加量的增加而降低，T2組與T3組均極顯著高于T1組(P<0.01)，T4組與T1組差異不顯著(P>0.05)。T2組和T3組的乙酸含量極顯著低于T1組(P<0.01)，而T4組與T1組差異不顯著。T3、T4組的丙酸含量極顯著高于處理T1、T2組(P<0.01)，但T1、T2組之間丙酸含量差異不顯著(P>0.05)，T3、T4組之間丙酸含量差異亦不顯著(P>0.05)。丁酸含量在T3組未檢測到，其余各組含量較少且各組無差異。

表2 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯發酵品質的影響Table 2 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage fermentation quality

2.3 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯微生物的影響

如表3所列，乳酸菌、霉菌數量隨開袋時間增長呈現增加趨勢，酵母菌在開袋第3天數量下降，然后升高。開袋后第1天T3組乳酸菌含量顯著低于其他3組(P< 0.05)；T1組中的酵母菌數量極顯著高于其他3個組(P<0.01)，霉菌數量最低，為3.30 lg cfu·g?1。第3天T4組的乳酸菌數量顯著高于其他3個組(P<0.05)，達7.46 lg cfu·g?1，4個處理組的霉菌數量差異不顯著(P>0.05)，T2組的酵母菌數量極顯著低于T1組和T3組(P<0.01)。開袋第6天T4組乳酸菌數量顯著高于其他3個組(P<0.05)，T1組的酵母菌數量極顯著高于其他3個組(P<0.01)，且T2組的酵母菌數量最低。

表3 不同處理組間苜蓿青貯開袋后微生物動態變化(干物質基礎)Table 3 Dynamic changesbetween different treatmentson microbial populationsafter opening daysof alfalfa silage(DM basis)

2.4 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯有氧穩定性的影響

在有氧暴露后，青貯料的有氧穩定性時間表現T3組最長(53.5 h)，T1組最短(51 h)。T1和T4組有氧暴露時間顯著低于T2和T3組(P< 0.05)(圖1)。

圖1 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯有氧穩定性的影響Figure 1 Effect of silage-specific compound cellulase on alfalfa silage aerobic stability

2.5 苜蓿青貯發酵品質V-score評分分析

采用V-score評分體系對4組青貯的品質進行綜合分析(表4)。結果表明，各組的青貯飼料總體評價均為良好(> 80分)，其中T3組的得分最高。

表4 不同處理組間苜蓿青貯V-score評分Table 4 V-score of different treatmentson microbial populations

3 討論

3.1 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯營養成分的影響

纖維素酶可以將青貯原料中的結構性糖類降解為單糖或雙糖，為乳酸的生成提供可利用發酵底物，同時纖維素酶中含有氧化還原酶，可以加快氧氣的消耗，為青貯提供厭氧環境，抑制腐敗菌的生長[19-21]。纖維素酶屬于青貯發酵促進劑，利用纖維素酶對青貯纖維素進行分解，增加可溶性碳水化合物含量，為乳酸菌活動提供能源，纖維素酶不引起蛋白質的分解，不降低粗蛋白含量[22]，這與本研究中處理組粗蛋白含量均高于對照組粗蛋白質含量的結果一致。而T3組氨態氮較高且乳酸菌含量較少，有害微生物快速生長，蛋白質的降解作用增強[23]，由此可解釋添加纖維素酶的3個處理組中T3組粗蛋白含量相對最低。本研究中添加青貯專用復合纖維素酶有效降低苜蓿青貯中NDF和ADF含量，這與徐然等[14]對光葉紫花苕(Vicia villosaRoth)的研究結果一致。木質素是一種結構復雜的高分子聚合物，真菌、細菌、放線菌等微生物和其他酶類物質可以有效降解木質素，但木質素在厭氧條件下很難被降解。由于添加纖維素酶使得苜蓿青貯中氧氣消耗加快，有效抑制好氧微生物和其他酶類對木質素的降解，所以在本研究中添加纖維素酶并沒有起到降低木質素的作用[24-26]。T3組可溶性碳水化合物含量最高，且NDF含量顯著低于其他3組，說明纖維素酶水解植物細胞壁產生的過量可溶性碳水化合物未被微生物完全利用[27]。T4組開袋第1 天乳酸菌含量高于其他3組，其他微生物含量也偏高，故T4組可溶性碳水化合物含量低于T3組。

3.2 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯發酵品質的影響

pH和氨態氮是評定青貯發酵品質的重要指標。各處理的乳酸含量均高于其他有機酸，乙酸含量高于丙酸和丁酸。因此，苜蓿青貯發酵屬于乳酸發酵與醋酸發酵相結合的混合型發酵，乳酸含量高是造成青貯pH 低的主要原因[28]。當苜蓿青貯中pH 迅速降至4.7以下時，抑制了有害菌丁酸梭菌的生長，乳酸菌成為優勢菌群進行繁殖，加速乳酸的積累，并產生少量的乙酸。可溶性碳水化合物的含量取決于乳酸菌的繁殖速度和酶解產糖之間的平衡，發酵過程中部分糖會轉化成乙醇，使青貯具有酒香味。纖維素酶的添加增加了乳酸的產量[29]，然而，在纖維素酶一定作用范圍內，過多的纖維素酶不利于乳酸菌與發酵底物的接觸[13]，導致乳酸含量下降。這也是本研究中纖維素酶3個處理組乳酸含量依次下降的原因之一，這與陳鑫珠等[13]對常規水分和低水分稻草青貯品質的影響研究結果一致。

丙酸在3種有機酸中抗真菌能力較強，但酸性最弱，其抑菌作用隨pH降低而增強[30]。Hristov[31]研究表明，添加纖維素酶、半纖維素酶等添加劑可以降低燕麥(Avena sativa)和普通黃耆(Astragalus propinquus)混合青貯飼料中氨態氮的生成量，這與本研究結果相反，可能是由于本研究以苜蓿為原料，青貯中蛋白含量高所引起。苜蓿青貯中丁酸梭菌可以產生丁酸，也可以分解蛋白質產生氨態氮，影響青貯氣味，降低適口性，影響采食[32-34]，T3組的青貯中并未檢測到丁酸，且氨態氮顯著高于其他3組，是由于蛋白自身過度降解所致。

3.3 青貯專用復合纖維素酶對苜蓿青貯微生物和有氧穩定性的影響

乳酸菌是青貯中起主要發酵作用的有益微生物，可以在厭氧條件下利用碳水化合物產生乳酸。在厭氧條件下，酵母菌可以利用青貯中的糖類繁殖并產生乙醇和二氧化碳，使其具有酒香味，但酵母菌的劇烈活動會引起青貯的二次發酵，不利于貯藏[35]。本研究中，無添加組的乳酸菌含量最低，酵母菌的含量最高，添加復合纖維素酶的青貯料中酵母菌含量降低，這與侯美玲等[36]對羊草(Leymus chinense)青貯品質研究結果相同，說明纖維素酶的添加降低青貯料pH 是有效抑制了酵母菌的繁殖所致。

在青貯開袋后，由于青貯料與空氣接觸，導致青貯中的好氧微生物開始活躍，使得青貯料變質進程開始，其中好氧微生物利用青貯中的營養物質進行大量繁殖[37]。隨著有氧暴露時間的增加，霉菌和酵母菌數量迅速上升，乳酸菌數量增長緩慢，與劉立山等[38]研究中乳酸菌數量降低的結果相反，這可能是因為好氧菌的快速繁殖消耗青貯中的氧氣，使厭氧菌進行緩慢繁殖。苜蓿青貯在開袋51～53 h 后已經開始變質，說明好氧微生物的霉菌和酵母菌開始快速繁殖。較低的pH 為青貯提供了穩定的發酵環境，可以更好地抑制腐敗菌的生長，使有氧穩定時間延長，而酵母菌可以利用乳酸產生酒精，并發生有氧變質[36]。添加酶制劑的3個組的有氧穩定性高于對照組，其中T3組的有氧穩定性最好；此外T2組和T3組的乳酸含量較高，乳酸具有一定的抗菌性，因此T2組和T3組的苜蓿青貯有氧穩定性顯著提高。

4 結論

本研究對4組添加不同濃度青貯專用復合纖維素酶的苜蓿青貯營養成分、發酵品質、微生物和有氧穩定性等指標進行了研究，結果表明，各組苜蓿青貯品質評定均能達到良好青貯品質標準。添加復合纖維素酶降低了青貯苜蓿中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量，減少了干物質損失，提高了苜蓿青貯營養價值；添加復合纖維素酶還可降低苜蓿青貯pH 和乙酸含量，提高乳酸含量和有氧穩定性，改善苜蓿青貯發酵品質。研究結果表明，4個處理組的青貯品質表現為T3組(5.0‰) >T2組(2.5‰)>T4組(7.5‰)>T1組(0)，即添加5.0‰的青貯專用復合纖維素酶青貯效果最好。