基于轉錄組測序篩選影響從江香豬產仔數的候選基因

張福平 唐靚婷 王嘉福 冉雪琴 李升 黃世會

張福平（1978-），博士，副教授，貴州省生態家禽產業發展專班副班長，貴州省畜牧獸醫學會家禽學分會理事長，貴州省畜禽遺傳資源委員會委員，主要從事地方家禽遺傳資源保護與開發利用研究工作。先后主持貴州省科技計劃項目“貴州黃雞種質資源創新利用研究”“優質赤水烏骨雞培育及高效養殖HACCP體系研究”“黔東南小香雞配套系選育及示范推廣”“高產綠殼蛋雞配套系選育及推廣”等科研項目20余項;主要參與國家科技支撐計劃項目1項、國家自然科學基金項目2項。獲貴州省科學技術進步獎三等獎1項;制定地方標準3項;主編《蛋雞養殖100問》養殖技術叢書1冊;在《Theriogenology》《南方農業學報》《中國畜牧獸醫》等科技期刊上發表學術論文60余篇。

摘要：【目的】篩選出影響從江香豬產仔性狀的基因調控網絡，揭示其繁殖分子機理，為后期開展從江香豬繁殖性能研究及良種選育提供理論依據。【方法】以高產仔家系（平均產仔數≥12頭，遺傳穩定）和低產仔家系（平均產仔數8～10頭，遺傳穩定）從江香豬為研究對象，選擇初情期不同產仔家系從江香豬卵巢組織各3個，使用Illumina HiSeqTM 2000測序儀進行轉錄組測序（RNA-Seq），并對篩選獲得的差異表達基因進行GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析，以尋找與從江香豬產仔數相關的基因調控網絡。【結果】從高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢組織中測序獲得的純凈序列（Clean reads）均超過5000萬條，且有96.00%以上的Clean reads能比對上豬參考基因組。以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標準，篩選獲得高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢組織差異表達基因212個，其中上調表達基因138個、下調表達基因74個。采用實時熒光定量PCR對隨機選擇的10個差異表達基因進行定量分析，發現OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高產仔家系從江香豬卵巢中的相對表達量顯著高于低產仔家系從江香豬（P<0.05，下同），而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低產仔家系從江香豬卵巢中的相對表達量顯著高于高產仔家系從江香豬，與RNA-Seq測序結果一致。212個差異表達基因共富集在48個GO功能條目上，包含分子功能（Molecular function）、生物學過程（Biological process）和細胞組分（Cellular component）;經KEGG信號通路分析發現共有70個差異表達基因注釋到特定的代謝信號通路上，其中顯著性富集的KEGG信號通路有類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌細胞腎上腺信號通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。在卵巢類固醇生成通路上發現SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7個基因與從江香豬的繁殖性能存在密切聯系。【結論】從江香豬卵巢類固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因與其發情排卵密切相關，于發情期上調表達能促進卵泡發育成熟及類固醇激素合成，通過增加排卵數量而促使從江香豬表現高產，故可作為從江香豬繁殖性狀的候選基因。

關鍵詞： 從江香豬;卵巢;產仔數;候選基因;轉錄組測序

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0847-10

Selection of candidate genes affecting litter size of Congjiang Xiang pig by transcriptome sequencing

ZHANG Fu-ping1，2， TANG Liang-ting1， WANG Jia-fu1*， RAN Xue-qin1，2，

LI Sheng1， HUANG Shi-hui2

（1Institute of Agro-bioengineering， Guizhou University/College of Life Sciences， Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education）， Guiyang? 550025， China; 2College of Animal Sciences，Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the breeding performance studies and breeding， gene regulatory networks and the molecular mechanism of reproduction traits on Congjiang Xiang pig were screened. 【Method】Three ovary tissues were selected from the high litter size family（number of average litter size≥12， stable inheri-tance） and the low litter size family（number of average litter size was 8-10， stable inheritance） at puberty， and transcriptome sequenced（RNA-Seq） by Illumina HiSeqTM 2000， and GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the differentially expressed genes（DEGs） to find the gene regulation networks related to litter size of Congjiang Xiang pigs. 【Result】More than 50 million Clean reads were obtained from sequencing results of ovaries from high litter size family? and low litter size family ， and more than 96.00% of the Clean reads could be mapped with the reference genome of pig. With |log2FC|≥1.0 and P<0.01 as the conditions，212 DEGs in ovary between high yield family and low yield family were found，and among which 138 were up-regulated genes， 74 down-regulated genes. Ten randomly selected DEGs was verified by real-time fluorescence quantitative PCR， the expression levels of OSAP， MSMB， FGFBP1， RLN， HAS1 and PLBD1 genes in the ovary of high litter size family were significantly higher than those in the low litter size family（P<0.05， the same below）. However， the expression levels of EDG7， PTX3， BSP1 and MRO genes were in the ovary of? low litter size family were significantly higher than those in the high litter size family. The results showed that the sequencing results were consistent with the results of qRT-PCR. A total of 212 DEGs were enriched in 48 GO functional items， including molecular function， biological process and cellular component. Through KEGG pathway analysis， a total of 70 DEGs were annotated to specific metabolic pathways. Significant enrichment pathways included steroid biosynthesis，calcium signaling pathway， ovarian steroidogenesis， adrenergic signaling in cardiom-yocytes and hypertrophic cardiomyopath（HCM）. On the ovarian steroidogenesis pathway， seven genes including SCARB1， STAR， COX2， CYP11A， CYP17A， 17P17A and CYP19A1 genes were found to be closely related to reproductive performance of Congjiang Xiang pigs. 【Conclusion】STAR， CYP11A， CYP17， 17βHSD and CYP19A1 genes in the ovarian steroidogenesis pathway are closely related to estrus and ovulation in pigs. These genes which are up-regulated during estrus can promote follicle development and maturation， steroid hormone expression， enhance high reproduction of Congjiang Xiang pigs by increasing the number of ovulation. Thus these genes can be used as candidate genes for bree-ding traits in Congjiang Xiang pigs.

Key words： Congjiang Xiang pig; ovary; litter size; candidate gene; transcriptome sequencing

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31672390）; National High Technology Research and Development Program（863 Plan） of China（2013AA102503）;Guizhou Science and Technology Talents Group Project（QKHPTRC〔2019〕-5615）;Guizhou Agriculture Research Project（QKHZC〔2017〕2585）

0 引言

【研究意義】從江香豬是我國著名的地方豬種，主產于貴州省從江縣的加榜、加鳩和宰便等8個鄉（鎮），1993年被列為國家二級保護畜種，2000年列入《國家級畜禽品種資源保護名錄》（農業部130號公告），2006年被列入《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》（農業部第662號公告）。從江香豬具有體型小、耐粗飼、適應性強、抗病能力強、肉質鮮美及性成熟早等優良特性（劉培瓊等，2011;楊家大等，2016），經過長期的自然選擇和人工選育，已形成近親繁殖不退化且基因高度純合的特征，是寶貴的豬種資源（黃仁建，1994）。但從江香豬存在繁殖力低的缺點，嚴重制約其產業的快速發展。2007和2014年的調查發現其平均產仔數為7～8頭（申學林等，2007），遠低于國內目前普遍飼養的外來豬種。此外，從江香豬的乳頭數相對較少。劉培瓊等（2011）研究發現56%的從江香豬乳頭數為5對，25%的個體乳頭數為6對，僅有1%的個體乳頭數為7對。因此，提高從江香豬繁殖力是促進其養殖產業快速發展的重要保障。【前人研究進展】香豬是原始小型豬種，具有近交不退化、可放牧飼養的特點，也是用作試驗動物的理想豬種（邱小田等，2013），包括從江香豬、劍白香豬、巴馬香豬、環江香豬及藏香豬等品種，均屬于矮小豬種（宋社果等，2011;李俊等，2015;莫家遠等，2020）。近年來，國內針對從江香豬繁殖力的研究已有較多報道。劉金娟等（2008）采用RT-PCR擴增從江香豬卵巢和子宮中雌激素受體α、β基因cDNA序列，結果發現這2個亞基均存在堿基突變，可導致氨基酸改變，影響雌激素受體與ERs蛋白的應答元件，最終影響從江香豬繁殖系統的發育。謝健（2016）利用Illumina Porcine SNP60K芯片篩選獲得從江香豬產仔數性狀的潛在候選基因ZEB1、PDIA4、MARCKS、HDAC2、CDC42、FSH-β和PRSS21等，發現ADAMTS-1、AR、KIT、MED12、PN-1和SOD1基因的拷貝數變異僅出現在高產香豬群體中，并推測ADAMTS-1基因第7外顯子5996位的多態性會影響其繁殖力。張笑等（2016）通過克隆從江香豬卵巢抑制素α（Inhibin-α，INHA）基因，檢測高、低產從江香豬群體中INHA基因的SNP多態性及INHA基因在2個群體間的表達差異，結果表明從江香豬INHA基因結構保守，主要通過基因表達量變化來調節從江香豬的卵巢生長和卵泡發育。岑永秀（2017）對從江香豬miRNA表達譜測序結果進行預測，并通過實時熒光定量PCR進行驗證，結果發現miR-449b-5p、miR-16-5p、let-7f-5p、miR-140-3p、miR-29c-3p及miR-1-3p等6個miRNA在其睪丸性成熟期起負調控作用。許瑤等（2017）研究發現卵泡刺激素受體（FSHR）基因錨定位點rs322800083和下游rs332115220位點構成的單倍型C-T在從江香豬群體中連鎖，與其二胎、三胎總產仔數關聯，可作為提高從江香豬產仔數的分子標記。盧圣菲（2018）對6頭從江香豬的重測序數據進行分析，結果在8號染色體上獲得8個結構變異位點，且均與繁殖相關QTL相重疊，其中MAN2B2-I3-sv100和NELFA-I1-sv40位點多態性與產仔數相關。【本研究切入點】目前，有關從江香豬繁殖性狀的研究主要針對單個基因或單個位點進行分析，為闡明香豬繁殖調控機理提供了理論依據，但從江香豬發情早且產仔數差異明顯的原因還有待進一步探究。【擬解決的關鍵問題】以高產仔家系和低產仔家系從江香豬為研究對象，分析2個家系初情期卵巢轉錄組的差異，篩選出影響產仔性狀的基因調控網絡，揭示其繁殖分子機理，為后期開展從江香豬繁殖性能研究及良種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選擇相同條件下飼養的高產仔家系（平均產仔數≥12頭，遺傳穩定）和低產仔家系（平均產仔數8～10頭，遺傳穩定）初情期從江香豬母豬（經發情鑒定，發情癥狀明顯，且用公豬試情接受爬跨）各3頭，高產仔家系組樣本分別標記為H1、H2和H3，低產仔家系組樣本分別標記為L1、L2和L3，宰殺后立即采集卵巢組織，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1. 2 轉錄組（RNA-Seq）測序分析

提取6頭從江香豬卵巢總RNA，純化后對其完整性和濃度進行檢測，檢測合格的樣品采用磁珠法分離純化mRNA，純化樣品經RNA Fragmentation Kit片段化后，構建11個樣本的mRNA文庫。構建好的文庫經質檢合格后，使用Illumina HiSeqTM 2000測序儀（美國）進行測序，回收測序數據，經FastQC軟件質控獲得純凈序列（Clean reads），然后對Clean reads進行基因和轉錄本定量分析;利用DESeq2_EBSeq對高產仔家系和低產仔家系轉錄本的表達量進行比較，以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標準，篩選高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢組織的差異表達基因。使用GOseq R軟件包進行差異表達基因的基因本體論（GO）功能富集分析，并以基于KEGG數據庫（http：//www.genome.jp/kegg/）進行信號通路富集分析。

1. 3 差異表達基因實時熒光定量PCR驗證

為進一步驗證RNA-Seq測序獲得高產仔家系和低產仔家系從江香豬發情期卵巢差異表達基因的準確性，隨機選擇10個差異表達基因，在Ensemble Gene ID下載相應基因cDNA序列，利用Primer 5.0設計特異性擴增引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β細胞骨架肌動蛋白基因（ACTB）（Ensembl：ENSG00000075624）為內參基因，對10個差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證。

2 結果與分析

2. 1 原始數據過濾統計結果

由于RNA-Seq測序獲得的原始序列（Raw reads）含有接頭序（Adapter reads）和低質量序列（Low quality reads），因此需要對Raw reads進行過濾以獲得Clean reads，確保后續的分析數據質量。由表2可知，在高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢樣品中發現有18280～36918條未知序列（Unknown reads），占Raw reads的0.04%～0.07%;去除Adapter reads和Low quality reads后，獲得50011936～50413430條Clean reads，占Raw reads的96.45%～97.23%。

2. 2 高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢轉錄組比對分析結果

將高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢樣本的Clean reads與豬參考基因（Sus_scrofa11.1）進行比對，結果發現有96.39%～96.81%的Clean reads能比對上豬參考基因組，其中比對到基因組唯一位置的Clean reads占94.22%～95.36%，而比對到基因組多個位置的Clean reads占1.46%～2.17%;比對到正鏈上的Clean reads占47.77%～48.06%，比對到負鏈上的Clean reads占47.97%～48.21%。

2. 3 差異表達基因篩選結果

以低產仔家系從江香豬（L組）為對照組，高產仔家系從江香豬（H組）為試驗組。本研究在6個從江香豬卵巢組織樣品共發現20561個表達基因，其中共表達基因19318個，H組特異性表達基因655個，L組特異性表達基因588個（圖1）。以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標準，篩選高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢組織差異表達基因，最終篩選獲得212個差異表達基因，其中上調表達基因138個、下調表達基因74個（圖2）。

2. 4 10個差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證結果

為驗證RNA-Seq測序結果的可靠性，選擇10個差異表達基因（OSAP、MSMB、FGFBP1、EDG7、PTX3、RLN、BSP1、MRO、HAS1和PLBD1）進行實時熒光定量PCR檢測，結果發現OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高產仔家系從江香豬卵巢中的相對表達量顯著高于低產仔家系從江香豬（P<0.05，下同），而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低產仔家系從江香豬卵巢中的相對表達量顯著高于高產仔家系從江香豬（圖3），即實時熒光定量PCR檢測結果與RNA-Seq測序結果趨勢一致。

2. 5 差異表達基因的GO功能富集分析結果

對篩選獲得的212個差異表達基因進行GO功能富集分析，結果發現這些差異表達基因共富集在48個GO功能條目上，包含分子功能（Molecular function）、生物學過程（Biological process）和細胞組分（Cellular component）（圖4）。在生物學過程組分中，細胞過程（Cellular process）類別所占比例最高，其次為單有機體過程（Single-organism process）類別，且包含生殖（Reproduction）及生殖過程（Reproductive process）2個與繁殖相關的生物學過程。在細胞組分中的19個分類中，以細胞（Cell）、細胞部分（Cell part）和細胞器（Organelle）類別所占比例較高，其次是膜組分（Membrane）。在分子功能組分涉及的18個分類中，以綁定分子功能（Binding）和催化活動（Catalytic activity）類別所占比例較高。

2. 6 差異表達基因的KEGG信號通路富集分析結果

KEGG信號通路分析發現，在高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢組織中共有70個差異表達基因注釋到特定的代謝信號通路上，富集到的前20條KEGG信號通路見圖5，其中顯著性富集的KEGG信號通路有5條（表4）：類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌細胞腎上腺信號通路（Adrenergic signa-ling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。此外，在卵巢類固醇生成通路上發現SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7個基因與從江香豬的繁殖性能存在密切聯系。

3 討論

卵巢是雌性哺乳動物的重要生殖器官。在發情周期中，卵巢上的卵母細胞增殖、分化及凋亡，會直接影響和決定雌性動物的排卵數量、受精率及其產仔數。卵巢功能的發揮必然伴隨著大量基因表達轉錄調控，本研究通過構建高產仔家系和低產仔家系從江香豬卵巢mRNA文庫，利用RNA-Seq測序技術從不同產仔家系豬卵巢中篩選出212個差異表達基因，發現許多上調表達基因參與類固醇激素代謝和生物合成、細胞黏附、有機物代謝及離子轉運和信號轉導，且部分上調表達基因為參與生殖的候選基因。NR5A1蛋白參與調控有性發育和生殖關鍵基因的轉錄（Jeyasuria et al.，2004），NR5A1基因失活則會導致卵巢發育不良，如NR5A1基因雙敲除小鼠卵巢雖有卵泡產生，但缺乏黃體，而呈現排卵障礙（Louren?o et al.，2009）;在腎上腺和性腺中發現STAR基因是膽固醇進入線粒體啟動類固醇生成的關鍵基因（Clark and Hudson，2015）;PAPSS2基因通過調控卵巢雄激素的表達效率，在調節卵巢功能方面發揮重要作用（Oostdijk et al.，2015）;MTHFD2基因可能對快速增殖細胞中線粒體NADH和NADPH的產生有促進作用（Shin et al.，2017）。許多下調表達基因則直接參與纖毛運動、受體信號通路、激素分泌、蛋白修飾和凋亡過程的調控。如TEKT1基因是精子細胞特異性基因，在精子發生和變態過程中發揮重要作用（Larsson et al.，2000），但其在卵巢中的功能尚不清楚;TSPAN基因是四聚氰胺家族的新成員，具有抑制細胞增殖和遷移等功能作用（Wang et al.，2011）;TGFβ家族具有控制卵泡發育的功能（Cela et al.，2016）;fyn相關激酶（FRK）是一種無受體的酪氨酸激酶，通過抑制上皮細胞向間質轉化而抑制細胞增殖、遷移和侵襲（Ogunbolude et al.，2017）。

本研究對篩選得到的差異表達基因進行KEGG信號通路分析，結果發現2條與繁殖相關的重要KEGG信號通路，即類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）和卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）。其中，卵巢類固醇生成通路是調控豬發情排卵的重要通路，與生物過程中激素相關的GO功能富集分析結果相符，進一步證實高產仔家系和低產仔家系從江香豬發情期卵巢間存在激素調節系統方面的差異。在卵巢類固醇生成通路上，高產仔家系從江香豬卵巢組織中的STAR、CYP11A、CYP17、17βHSD和CYP19A1基因均呈上調表達趨勢，即促進雌二醇表達，而雌二醇表達水平又直接影響母豬產仔數（Robic et al.，2014）。類固醇激素是一系列生殖生理活動所必需的激素，其作為機體化學信使，在生物體的發育和成熟過程中發揮重要作用。目前，已發現與類固醇激素合成相關的限速酶基因有STAR基因、細胞色素P450家族及羥基類固醇脫氫酶類基因（HSDs）。細胞色素P450是一類存在于肝細胞微粒體上的超基因大家族，對動物機體內源性物質和外源性化合物具有重要的生物轉化作用（Da-nielson，2002）。細胞色素P450還參與固醇和類固醇激素的生物合成，尤其是在生殖激素調節中扮演著重要角色（Kandiel et al.，2010）。與豬繁殖性能相關的細胞色素P450家族基因有CYP11A1、CYP11B、CYP17、CYP19A1、CYP19A2、CYP19A3和CYP21。本研究發現，CYP17、CYP11A和CYP19A1基因在卵巢類固醇生成通路上均高表達，說明這3個基因對高產仔家系從江香豬發情期的排卵功能有顯著影響。已有的研究表明，哺乳動物卵巢CYP19A1是雌激素合成相關的限速酶，除了參與類固醇激素的合成外，還能調節卵泡生成（Hatey et al.，1992）。應詩家等（2013）利用同期發情技術處理綿羊后，發現其卵巢黃體后期直徑>2.5 mm卵泡中的CYP17A1和CYP19A1基因表達水平極顯著高于直徑為2.5 mm卵泡中的表達水平，說明CYP17A1和CYP19A1基因對綿羊的卵泡發育有直接影響。此外，CYP11A1基因突變會導致卵巢多囊綜合癥（Zhang et al.，2012）。

17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSDs）是一類NAD（P）H/NAD（P）+依賴的氧化還原酶家族，在哺乳動物中發現該基因共有14個成員，其中17β-HSD1（Saloniemi et al.，2009）、17β-HSD2（Rantakari et al.，2008）、17β-HSD3（Adamski and Jakob，2001）、17β-HSD4（Baes，2000）、17β-HSD5（Penning et al.，2000）和17β-HSD12（Rantakari et al.，2010）6種17β-HSDs與雌激素的氧化、還原和代謝密切相關。本研究檢測到17β-HSD1基因在高產仔家系從江香豬卵巢組織中呈上調表達。在諸多物種中，17β-HSD1在雌酮轉化為雌二醇（E2）的過程中發揮重要作用，而HSD17B1基因異常表達與許多雌激素依賴性疾病相關，包括乳腺癌、子宮內膜癌、子宮內膜異位癥和子宮內膜息肉等（Feigelson et al.，2006;Cong et al.，2012;劉博等，2014）。沈峻宇等（2015）利用PCR-RFLP對新西蘭兔17β-HSD1基因進行分型，并對該基因突變位點與繁殖性狀進行最小二乘法分析，結果發現17β-HSD1基因與母兔繁殖性狀顯著關聯，其中c.1509C>T突變位點與家兔繁殖性能有較強的相關性，可作為家兔遺傳改良的分子標記。盧圣菲等（2018）研究發現在從江香豬17β-HSD12基因的SV225位點存在2個ESE和3個ISE可變剪接調控元件，而這些剪接調控元件可能有助于17B-HSD12基因的轉錄本加工，提高基因轉錄效率，促進雌激素生成，進而影響從江香豬發情排卵。綜上所述，在發情期，高產仔家系從江香豬卵巢組織中的STAR和17βHSD等基因上調表達，促進卵泡發育成熟及類固醇激素合成，最終通過增加排卵數量而促使從江香豬表現高產。

4 結論

從江香豬卵巢類固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因與其發情排卵密切相關，于發情期上調表達能促進卵泡發育成熟及類固醇激素合成，通過增加排卵數量而促使從江香豬表現高產，故可作為香豬繁殖性狀的候選基因。

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（責任編輯 蘭宗寶）