番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除載體的構建

黃萍 劉洪 王慧 周倩

摘要：【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因，并構建SlCmr1基因敲除載體，為研究該基因功能打下基礎。【方法】根據NCBI數據庫提供的番茄匍柄霉基因組信息設計引物，PCR擴增得到SlCmr1基因的DNA全長和CDS序列，并對SlCmr1基因編碼的蛋白進行生物信息學分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列設計引物，分別PCR擴增SlCmr1基因的上、下游片段，通過酶切連接的方法將SlCmr1基因的上、下游序列分別插入載體pCX62，構建SlCmr1基因敲除載體。【結果】SlCmr1基因的DNA全長為3275 bp，CDS長度為3018 bp，有3個內含子，編碼蛋白序列全長1005 aa，分子式為C4882H7642N1404O1499S61，分子量為111.94 kD，理論等電點為（pI）6.64，半衰期30 h，不穩定指數58.72，親/疏水性平均值為-0.424，預測亞細胞定位于細胞核，存在2個相鄰的ZnF_C2H2結構域和1個GAL4結構域，推測SlCMR1為不含跨膜區域的非分泌、不穩定可溶性蛋白。分別將SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62載體，成功構建了基因敲除載體pCX62-SlCmr1。【結論】SlCmr1可能是真菌調控色素合成的關鍵基因，在真菌的次級代謝產物合成中發揮重要作用。

關鍵詞： 番茄匍柄霉;SlCmr1基因;基因克隆;生物信息學分析;基因敲除載體構建

中圖分類號： S432.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0976-08

Cloning and knockout vector construction of SlCmr1 gene in Stemphylium lycopersici

HUANG Ping， LIU Hong， WANG Hui， ZHOU Qian*

（College of Plant Protection，Hunan Agricultural University/Hunan Provincial Key Laboratory for Biology

and Control of Plant Diseases and Insects Pests， Changsha? 410128， China）

Abstract：【Objective】In order to study the function of SlCmr1 gene in Stemphylium lycopersici， cloning? of SlCmr1 gene was carried out， and gene knockout vector was constructed. 【Method】The primers of SlCmr1 gene were designed according to the S.lycopersici genome sequence provided by NCBI database. The full length DNA and CDS sequence of SlCmr1 gene were obtained by PCR amplification and the protein coded by SlCmr1 gene was analyzed through bioin formatics methods. Sequences around 1100 bp upstream and downstream of SlCmr1 gene were used to design primers. The upstream and downstream sequences of SlCmr1 were amplified by PCR and inserted into pCX62 vector by restriction enzyme digestion and SlCmr1 gene knockout vector was constructed. 【Result】SlCmr1 gene was 3275 bp in DNA sequence and 3018 bp in CDS sequence， including 3 introns， encoded 1005 amino acid protein sequence with molecular formula C4882H7642N1404O1499S61 and molecular weight 111.94 kD， predicted isoelectric point（pI） 6.64， half-life 30 h， instability index 58.72， mean value of hydrophilicity/hydrophobicity -0.424 and subcellular localization in nucleus. It was speculated that SlCMR1 was a non-secretory， unstable soluble protein without transmembrane region， and there were 2 adjacent ZnF_C2H2 domains and 1 GAL4 domain. SlCmr1 gene knockout vector pCX62-SlCmr1 was successfully constructed by inserting the upstream and downstream fragments of SlCmr1 gene into pCX62 vector. 【Conclusion】Slcmr1 may be a key gene regulating pigment synthesis and play an important role in the secondary metabolite synthesis in fungi.

Key words： Stemphylium lycopersici; SlCmr1 gene; gene cloning; bioinformatics analysis; construction of gene knockout vector

Foundation item： Hunan Natural Science Foundation（2018JJ3220）; Scientific Research Project of Hunan Education Department（19K040）

0 引言

【研究意義】匍柄霉屬（Stemphylium Wallroth）是無性真菌暗色絲孢科的重要類群，其中許多成員是植物上常見的弱寄生致病菌，可產生毒素殺死寄主細胞后從死亡的組織中獲取營養。番茄匍柄霉（S. lycopersici）是其中致病力較強、危害較大、寄主范圍較廣的成員之一，常為害番茄、萵苣、辣椒和甘藍等蔬菜，引起葉斑病。在我國由番茄匍柄霉引起的發生面積和危害程度最大的病害是番茄匍柄霉葉斑病，又稱番茄灰葉斑病，該病在環境濕度大、氣溫不穩定的陰天發生快速，擴散能力強，現已在我國許多地方大面積暴發，嚴重影響番茄的產量和品質，造成巨大經濟損失（李寶聚等，2010）。Cmr1基因普遍存在于真菌中，編碼包含2個相鄰的ZnF_C2H2結構域和1個Zn（II）2Cys6結構域的轉錄因子（Tsuji et al.，2000）。本課題組前期研究發現，引起萵苣葉斑病的番茄匍柄霉菌株致病力強弱與其橙色色素的產量呈正相關，轉錄組測序結果顯示產色素少的菌株中Cmr1的同源基因表達量下調，這一發現與前人研究結果矛盾（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）。因此，開展對番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆、生物信息學分析及基因敲除載體構建的研究，可為后續進一步探討該基因編碼的蛋白在真菌色素合成調控中的作用打下基礎。【前人研究進展】有關Cmr1及其同源基因的研究最早在黃瓜炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中報道，發現它們編碼的蛋白是與真菌菌絲中黑色素合成相關的轉錄因子（Tsuji et al.，2000）。水稻胡麻病菌（Bipolaris oryzae）中Cmr1的同源基因Bmr1過表達導致黑色素的合成增加（Kihara et al.，2008）。鏈格孢（A.alternata）中Cmr1的同源基因CmrA沉默后黑色素合成抑制，導致菌落呈白色（Fetzner et al.，2014）。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中VdCmr1基因也是調控黑色素合成的關鍵因子（Wang et al.，2018）。灰霉（Botrytis cinerea）和盾殼霉（Coniothyrium minitans）中Cmr1的同源基因均與黑色素合成相關（Schumacher，2016;Luo et al.，2018）。Eliahu等（2007）在研究玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）時發現Cmr1基因缺失的突變體菌落不產生黑色素，但會產生橙粉色素。隨后在蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola）中報道，Cmr1同源基因Amr1缺失也在導致菌落黑色素合成抑制的同時橙色色素合成增加，并且Amr1缺失突變體對寄主的致病力顯著增強（Cho et al.，2012）。目前，關于Cmr1及其同源基因功能的報道均是正調控黑色素的形成，在玉米小斑病菌（Eliahu et al.，2007）和蕓薹生鏈格孢（Cho et al.，2012）的研究中還發現它們同時負調控橙色色素的合成，且蕓薹生鏈格孢的Amr1基因還控制病菌的致病力。【本研究切入點】番茄匍柄霉在我國引起多種蔬菜葉斑病，嚴重影響我國蔬菜的質量和產量，但目前有關番茄匍柄霉色素合成及致病力相關基因的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】從橙色色素產量高、致病力強的番茄匍柄霉菌株CS12中克隆SlCmr1基因及其CDS序列，對其編碼的蛋白進行生物信息學分析，并構建SlCmr1基因敲除載體，為下一步在番茄匍柄霉中敲除該基因，明確番茄匍柄霉中該基因的功能打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試番茄匍柄霉菌株CS12由植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室分離培養并保存。pCX62載體為南京農業大學張正光教授惠贈。總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、Pfu酶、DNA純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司;限制性內切酶Hind III、Kpn I、BamH I和Xba I購自TaKaRa公司，T4連接酶購自Promega公司，其余試劑均為國產分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 番茄匍柄霉DNA、總RNA提取及cDNA合成 將液體培養的菌株CS12用CTAB法（李煥宇等，2017）提取DNA，根據總RNA提取試劑盒說明書提取菌株CS12的總RNA，利用反轉錄試劑盒獲得菌株CS12的cDNA。DNA和總RNA分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

1. 2. 2 SlCmr1基因全長及CDS序列克隆 根據轉錄組測序數據和NCBI中番茄匍柄霉SlCmr1基因序列，用Primer 5.0設計引物，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。PCR反應體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA或cDNA模板2.0 μL，Pfu酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行34個循環;72 ℃延伸5 min。DNA和cDNA的PCR產物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 2. 3 SlCMR1蛋白的生物信息學分析 利用ProtParam、SOSUI、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1和SignalP 5.0等在線工具對SlCMR1蛋白進行生物信息學分析。將SlCMR1在NCBI數據庫BLAST中進行同源性比對，得到不同物種SlCmr1基因的氨基酸序列，在GeneDoc中進行多重序列比對，使用MEME分析3個相似度最高的Motif。使用MEGA 7.0對BLAST的結果進行氨基酸序列多重比對，采用鄰接法構建系統發育進化樹。

1. 2. 4 SlCmr1基因敲除載體的構建 根據番茄匍柄霉SlCmr1基因的上、下游1000 bp左右的序列，各設計1對加入酶切位點的引物（表1）。構建基因敲除載體的方法為在pCX62載體潮霉素基因的兩端分別插入SlCmr1基因的上、下游片段（圖1）。具體過程與方法：對SlCmr1基因的上、下游分別進行PCR擴增（PCR反應體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，Pfu酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行34個循環;72 ℃延伸5 min），PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果正確的上、下游PCR產物（SlCmr1SY和SlCmr1XY）分別純化回收，紫外分光光度計測量濃度、檢測質量。提取pCX62質粒，分別將質粒和下游PCR純化產物進行雙酶切（BamH I和Xba I）處理，酶切體系10.0 μL：10×M Buffer 5.0 μL，限制性內切酶各2.0 μL，DNA 2.0 μL（約400 ng/μL），ddH2O補足至10.0 μL。反應條件：37 ℃ 4 h。將酶切產物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用試劑盒進行純化回收。T4連接酶連接回收的載體和下游酶切產物，連接體系20.0 μL：T4 Buffer 2.0 μL，T4酶1.0 μL，載體質粒酶切純化產物1.0 μL（約100 ng/μL），下游酶切純化產物5.0 μL（約160 ng/μL）。反應程序：22 ℃ 20 min，65 ℃ 10 min。連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑取單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。測序正確的載體質粒（pCX62-SlCmr1XY）與上游PCR產物（SlCmr1SY）分別進行雙酶切（Kpn I和Hind III）、連接轉化處理，體系與反應程序同上，選擇測序正確的敲除載體pCX62-SlCmr1。

2 結果與分析

2. 1 SlCmr1基因克隆結果

分別以番茄匍柄霉菌株CS12的DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物測序，得到SlCmr1基因的DNA全長為3275 bp，CDS長度為3018 bp（圖2）;在NCBI數據庫BLASTn中將DNA序列與CDS序列進行比對，結果顯示其存在3個內含子。

2. 2 SlCMR1蛋白理化性質預測分析結果

由ProtParam可知SlCmr1基因編碼蛋白序列全長1005 aa，理論等電點（pI）為6.64，分子式為C4882H7642 N1404O1499S61，分子量為111.94 kD，原子總數為15488，其帶有負電荷殘基總數（Asp+Glu）97個，帶正電荷殘基總數（Arg+Lys）92個。在理論數據的基礎上得出半衰期為30 h，不穩定指數58.72，親/疏水性平均值為-0.424（圖3），故推測其為不穩定的可溶性蛋白。

2. 3 SlCMR1蛋白保守結構域分析結果

利用SMART在線預測網站分析SlCMR1蛋白的保守結構域，可得到其存在2個相鄰的ZnF_C2H2結構域（Cys2His2 zinc finger：2～24 aa和30～52 aa）和1個GAL4結構域[Zn（II）2Cys6：73～116 aa]（圖4-A）。在SOPMA中預測SlCMR1蛋白的二級結構，結果顯示α-螺旋占34.93%，無規則卷曲占52.74%，延伸鏈占9.85%，β-折疊占2.49%（圖4-B）。在PSIPRED V4.0在線預測網站，使用SWISS-MODEL在線同源建模，對SlCMR1蛋白的三級結構進行預測，結果證實其主要由α-螺旋和無規則卷曲組成（圖4-C），二者預測的結果一致。

2. 4 SlCMR1蛋白跨膜結構分析結果

用SignalP 5.0在線網站分析S1CMR1蛋白，結果表明其可能含有信號肽的概率為0.11%，因此推測S1CMR1為非分泌蛋白;于TMHMM Server v.2.0在線預測網站中分析SlCMR1蛋白，發現其不含跨膜結構;WoLF PSORT在線預測，推測其定位在細胞核中。使用NetPhos 3.1在線預測分析，結果（圖5）顯示SlCMR1中共有130個分值在0.5以上可能發生磷酸化的氨基酸位點，其中絲氨酸磷酸化位點89個、蘇氨酸磷酸化位點35個、酪氨酸磷酸化位點6個。

2. 5 SlCMR1蛋白系統發育進化分析結果

SlCmr1基因編碼的蛋白序列在NCBI數據庫中進行BLASTp同源性搜索比對，得到不同物種的CMR1蛋白序列。將SlCMR1蛋白序列與番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici，KNG52672.1）、小麥根腐離孺孢（Bipolaris sorokiniana，KAF5844733.1）、稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae，XP 007683728.1）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica，XP 008022458.1）、蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola，AEN02471.1）、圓核腔菌（Pyrenophora teres，CAA9962123.1）、偃麥草核腔菌（Pyrenophora tritici-repentis，XP 0019336 51.1）、枝孢菌（Clathrospora，KAF1946502.1）、小檗葫蘆霉（Cucurbitaria berberidis，KAF1843946.1）、棘殼孢葉斑病菌（Pyrenochaeta sp.，OAL46131.1）、殼多孢屬（Stagonospora sp.，OAK99817.1）和多主棒孢霉（Corynespora cassiicola，PSN62609.1）中的同源序列在MEGA 7.0中進行多重序列比對，比對結果采用鄰接法構建系統發育進化樹（圖6）。同源性比對結果顯示，SlCMR1蛋白序列與數據庫中收錄的番茄匍柄霉CMR1蛋白序列僅相差1個氨基酸，推測為不同菌株間的差異。

使用GeneDoc將相似性最高的幾個物種的CMR1與SlCMR1蛋白進行多重序列比對，并將兩相鄰的ZnF_C2H2結構域和GAL4結構域標出（圖7），于MEME在線預測網站中將SlCMR1蛋白與其相似性最高的幾個蛋白序列進行搜索，找到3個相似性最高的片段，并對其進行標注（圖8）。由圖8可見，SlCMR1蛋白與不同物種的CMR1蛋白間同源性較高的Motif區域分別為a（3～52 aa）、b（57～106 aa）和c（818～867 aa）等3處，其中，a中包括2個相鄰的ZnF_C2H2結構域，b中含有GAL4結構域，與保守結構域預測分析及多重序列比對結果一致。

2. 6 SlCmr1基因敲除載體構建

用菌株CS12的DNA為模板，使用上游引物Cmr1SY-F、Cmr1SY-R和下游引物Cmr1XY-F、Cmr1XY-R分別擴增出SlCmr1基因的上、下游片段，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（圖9）。上、下游片段大小均與預期一致。將載體質粒與下游片段進行酶切、連接及轉化，挑取單菌落進行PCR檢測，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到測序正確的含有下游片段的重組載體pCX62-SlCmr1XY。再將上游片段與重組載體pCX62-Sl-Cmr1XY進行上述操作，得到測序正確的重組敲除載體pCX62-SlCmr1。

由于pCX62和上游片段中各有1個BamHⅠ酶切位點，因此將敲除載體pCX62-SlCmr1進行BamHⅠ單酶切驗證（圖10），得到2條明亮的條帶，一條大小約為5000 bp，與pCX62載體、部分上游片段和下游片段相加的大小（4493 bp）相符，另一條帶的大小約為2000 bp，與部分上游片段和潮霉素B相加的大小（1971 bp）相符。單酶切驗證結果與重組載體測序結果一致，說明成功構建了敲除載體pCX62-SlCmr1，后續可使用該載體進行真菌遺傳轉化，進一步探究該基因的功能。

3 討論

Cmr1廣泛存在于真菌中，是一類重要的轉錄因子，但目前關于該轉錄因子功能的研究報道有限。有研究證明該轉錄因子及同源物正調控真菌中的黑色素合成，Cmr1基因敲除后，黑色素的合成被阻斷（Schumacher，2016;Luo et al.，2018），另有研究表明Cmr1基因敲除后不僅抑制黑色素合成，還增加了橙色色素合成（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）。鄭露（2010）發現引起大蒜白斑病的茄匍柄霉（S. solani）的致病力與其合成的橙色色素有關，該色素是一種非寄主專化性毒素。本課題組前期研究發現番茄匍柄霉的致病力也與病菌產生橙色色素的能力呈正相關，說明橙色色素可能是與匍柄霉致病有關的毒素。為了解番茄匍柄霉橙色色素合成的機制，本課題組前期對色素產生能力不同的番茄匍柄霉菌株進行了轉錄組測序，發現SlCmr1基因在致病力弱的菌株中表達量低，這一結果與鏈格孢中Cmr1同源基因Amr1敲除后橙色色素增加，致病力增強（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）的報道矛盾。SlCmr1基因的功能如何，是否與橙色色素合成及致病力有關，尚缺乏深入了解。本研究從高產橙色色素的番茄匍柄霉菌株CS12中克隆得到SlCmr1的DNA序列及CDS序列，通過生物信息學分析發現，SlCmr1基因編碼蛋白序列全長1005 aa，與NCBI數據庫中番茄匍柄霉的CMR1蛋白序列僅相差1個氨基酸，推測為不同菌株造成的差異。該蛋白包含2個相鄰的ZnF_C2H2結構域和1個GAL4結構域，是典型的轉錄因子。ZnF_C2H2的DNA結合基序最初在轉錄因子TFIIIA中發現并報道，與5S RNA基因的內部控制區結合，調控轉錄（Miller et al.，1985）。GAL4含有Zn（II）2Cys6雙核簇DNA結合基序，是真菌轉錄因子所特有的結構域（Todd and Andrianopoulos，1997）。Zn（II）2Cys6雙核簇基序的缺失能使黑色素完全丟失，而ZnF_C2H2的缺失僅會導致黑色素合成減少（Tsuji et al.，2000）。在敲除了Cmr1基因的玉米小斑病菌中調控黑色素合成相關基因BRN1、BRN2和SCD1的表達被完全抑制，而聚酮合成酶基因PKS18的表達量僅表現降低，同時發現Cmr1基因的正、負鏈均能轉錄，并受2個MAPK基因Chk1和Mps1的調控（Eliahu et al.，2007）。在產黑色素短梗霉（Aureobasidium melanogenum）XJ5?1菌株中，Cmr1與PKS1基因啟動子的TTCTCCA序列特異性結合，激活PKS1基因及黑色素合成相關基因T4HR1和SCD1的表達（Jiang et al.，2020）。說明在不同的真菌中，黑色素的合成可能由不同的聚酮合成酶（PKS）負責骨架的合成，其不同程度受Cmr1基因的調控。番茄匍柄霉產生橙色色素少的菌株中SlCmr1基因的表達量低，但其原因尚未明確。因此，本研究構建了SlCmr1基因的敲除載體，為后續對番茄匍柄霉菌株進行基因敲除以分析SlCmr1的功能打下了基礎。

4 結論

SlCmr1可能是真菌調控色素合成的關鍵基因，在真菌的次級代謝產物合成中發揮重要作用。本研究成功構建了敲除載體pCX62-SlCmr1，為后續進一步探討該基因在色素合成中的作用打下了基礎。

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（責任編輯 麻小燕）