菜心EMS誘變條件優(yōu)化與突變體庫構(gòu)建

張艷 洪曉如 黎庭耀 沈卓 楊易 周軒 陳漢才

摘要：【目的】明確甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理菜心種子的最佳濃度和處理時間，為EMS誘變技術(shù)在菜心種質(zhì)資源創(chuàng)新利用方面及豐富菜心種質(zhì)資源選育提供支持。【方法】設(shè)4種不同濃度的EMS溶液（0.2%，0.4%，0.6%和0.8%）和3種不同處理時間（8、12和16 h）共12個組合，誘變處理2個菜心自交系（C40和小80天）的種子，并對誘變后代出苗率和結(jié)籽株比例進行分析，篩選EMS誘變菜心種子的最佳處理條件。【結(jié)果】隨著EMS濃度的增加，菜心種子成苗率和結(jié)籽株比例逐漸降低。誘變處理8 h，EMS濃度為0.6%時，C40和小80天菜心的成苗率分別65%和70%，結(jié)籽株比例分別為13%和31%;EMS濃度升高至0.8%時，C40菜心的成苗率降至50%，2個菜心材料的結(jié)籽株比例均低于20%。隨著EMS處理時間的延長，菜心種子成苗率和結(jié)籽株比例逐漸降低。EMS處理濃度為0.4%時，誘變12 h，2個菜心材料（C40和小80天）的成苗率均為75%，結(jié)籽株比例分別為30%和45%;誘變16 h，C40和小80天菜心的成苗率分別降至60%和55%，結(jié)籽株比例均低于20%。EMS誘變處理不僅抑制成苗率，還嚴重影響結(jié)實情況。根據(jù)成苗率和M1群體植株的結(jié)籽株比例，并保證最大誘變效率和突變體群體，確定菜心種子EMS誘變處理的最佳條件為0.4% EMS誘變處理12 h。不同基因型菜心材料對EMS的耐受性不同，生長勢強的菜心材料EMS處理的時間或濃度可適當增大或降低。采用最佳誘變條件處理3000粒小80天菜心種子，在M1群體中出現(xiàn)黃化、白化、皺縮、矮化及嵌合等變異性狀，M1群體包含500個突變株系。隨機選取種子量大的M1群體中176個家系，構(gòu)建包含2110個單株的M2群體，在M2群體中發(fā)現(xiàn)94個突變單株，總的突變頻率為4.3%。其中，葉片葉色或形狀突變的單株61株，株型變異的單株共31株，花色突變的單株2株。【結(jié)論】利用EMS誘變菜心種子有明顯效果，構(gòu)建的菜心EMS突變體庫表型變異豐富，尤其是出現(xiàn)株型緊湊，葉色濃綠的有益突變，可用于菜心功能基因組學研究和育種。

關(guān)鍵詞： 菜心;EMS誘變;突變體庫;表型變異

中圖分類號： S634.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-1022-08

Optimization of EMS mutagenesis condition and construction of mutant library in flowering Chinese cabbage

ZHANG Yan， HONG Xiao-ru， LI Ting-yao， SHEN Zhuo， YANG Yi，

ZHOU Xuan， CHEN Han-cai*

（Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou? 510640， China）

Abstract：【Objective】This research aimed to clarify the optimal concentration and time of ethylmethylsulfone（EMS） mutation treatment of flowering Chinese cabbage， it provided support for the innovation and utilization of EMS mutagenic technology in flowering Chinese cabbage germplasm resources and enriching the selection of flowering Chinese cabbage germplasm resources. 【Method】Two high-generation inbred lines C40 and Xiao 80 Days were mutated by EMS solution of different concentrations（0.2%， 0.4%， 0.6% and 0.8%） under different treatment times（8， 12 and 16 h）. The adult plant rate and rate of seed-setting plant after mutation were investigated to determine the best mutagenesis conditions. 【Result】Under the same EMS treatment time， the adult plant rate and seed-setting plant rate of flowering Chinese cabbage decreased gradually with the increase of EMS concentration. When the EMS concentration was 0.6%， the adult plant rate of C40 and Xiao 80 Days were 65% and 70%， respectively; and the seed-setting plant rate of two materials were 13% and 31% respectively. When EMS concentration was 0.8%， the adult plant rate of C40 decreased to 50%， and the seed-setting plant rate of both materials was less than 20%. Under the same concentration of EMS， the longer the mutagenesis time was， the worse the adult plant rate and seed-setting plant rate. When EMS concentration was 0.4%， mutagenesis time was 12 h， the adult plant rates of C40 and Xiao 80 Days were both 75%， and the the seed-setting plant rate of two materials were 30% and 45% respectively. After 16 h， the adult plant rates were reduced to 60% and 55%， and the seed-setting plant rates were reduced， both below 20%. EMS treatment not only inhibited the adult plant rate， but also seriously affected the seed-setting plant rate. According to the adult plant rate and the seed-setting plant rate of M1 population， and to ensure the maximum mutation efficiency and mutant population， the optimal EMS mutatgenic condition was determined as 0.4% EMS mutation treatment for 12 h. The tolerance of different genotypes of flowering Chinese cabbage to EMS was different， and the treatment time or concentration of EMS could be appropriately increased or decreased on plants grew well. 3000 seeds of Xiao 80 Days were treated with the best mutagenic conditions， and 500 M1 mutant lines were obtained. In M1 population， there were some variation characters such as yellowing， albinism， shrinkage， dwarfing and chimerism. 176 M1 families with large seed quantity were randomly selected to construct M2 population with 2110 individuals. 94 mutant individuals were found in M2 population， and the total mutation frequency was 4.3%. There were 61 plants with leaf color or shape mutation， 31 plants with plant type mutation and 2 plants with flower color mutation. 【Conclusion】EMS mutagenesis of flowering Chinese cabbage seed has obvious effect. The EMS mutant library is rich in phenotypic variation， especially the beneficial mutation of compact plant type and dark green leaf color， which can be used in the functional genomics research and breeding of flowering Chinese cabbage.

Key words： flowering Chinese cabbage; EMS mutagenesis; mutant library; phenotypic mutation

Foundation item： Key Area Research and Development Project of Guangdong（2018B020202010）;Science and Technology Project of Guangdong（2018A050506051）; Science and Technology Project of Guangzhou（202002020007）

0 引言

【研究意義】菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，是廣東省栽培面積最大的蔬菜品種。因其獨特的風味和優(yōu)異的品質(zhì)，2006年以來菜心在北方地區(qū)及長江流域栽培面積逐年增加（張華和劉自珠，2010;李光光等，2011;張艷等，2016）。但是在育種研究方面，由于片面追求高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性逐漸喪失，使得菜心抵抗環(huán)境脅迫的能力變得十分脆弱，給其產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來極大風險（張艷等，2016）。利用誘變技術(shù)創(chuàng)造有利變異是解決當前菜心育種遺傳資源狹窄、種質(zhì)資源匱乏的有效途徑之一。【前人研究進展】甲基磺酸乙酯（EMS）是一種廣泛使用的化學誘變劑，具有效率高、負作用小、易操作等優(yōu)點，且產(chǎn)生的突變以點突變?yōu)橹鳎子谶z傳分析，目前已被廣泛應用于植物的相關(guān)遺傳研究和誘變育種工作中（Greene et al.，2003;谷福林等，2004）。在玉米中，王環(huán)環(huán)等（2014）通過EMS誘變篩選出1個花器官異常發(fā)育的突變體apl，并將其定位在1號染色體上;譚義川（2015）通過EMS誘變篩選出4份抗旱性較好的突變株系;周文期等（2020）利用EMS誘變玉米自交系K22花粉，分離到調(diào)控玉米葉形態(tài)建成相關(guān)突變體sep-1和dsp-1，并對調(diào)控表皮形態(tài)建成的候選基因進行圖位克隆。在水稻中，Lee和Lee（2002）利用EMS處理水稻花藥愈傷組織，從A2代雙單倍體中篩選出14個穩(wěn)定突變體、4個半矮化突變體、2個顆粒型突變體和8個無毛突變體;陳忠明和王秀娥（2005）通過EMS誘變恢復系9311種子篩選獲得大粒突變體M316，M316整精米的粒長由原來的6.9 mm增加到8.0 mm，千粒重由原來的31.0 g提高到35.6 g;葉俊等（2006）利用EMS溶液處理秈稻9311種子，獲得210份葉、莖、穗和根等性狀變異的突變體;倪浩凌等（2020）利用水稻EMS誘變突變體庫，通過田間篩選，得到9個穗發(fā)芽突變體，對其中的2個突變體進行突變基因定位克隆，分別獲得穗發(fā)芽候選基因LOC_Os03g08570和LOC_Os07g10490。在蕓薹屬作物中，利用EMS誘變構(gòu)建突變體庫主要集中在甘藍型油菜、白菜型油菜及大白菜上。通過EMS誘變不同油菜品種，前人創(chuàng)建了多個油菜突變體庫（Wang et al.，2008;石從廣等，2010;曲高平，2014;楊建勝等，2018），這些突變體庫包括形態(tài)變異、品質(zhì)變異及生理學特性變異等新種質(zhì)。Guirgis等（2009）用EMS誘變印度芥菜型油菜來選擇對重金屬有抗性的突變體，從EMS突變后代篩選出4個對重金屬有抗性的超富集植株。Zeng等（2011）用EMS誘變甘藍型油菜自交系T6，并從突變后代中獲得1個矮稈株突變體。Harloff等（2012）用EMS分別誘變油菜品種YNO-429和Express 617，獲得2個突變體庫，分別篩選出229和341個突變體。在大白菜中，盧銀等（2015）、黃勝楠（2016）構(gòu)建了表型豐富的大白菜突變體庫，篩選出持綠、花瓣退化及雄性不育等多個突變體;Fu等（2020）通過EMS誘變，篩選到13份早抽薹突變體，對其中的2份突變體進行基因定位克隆，發(fā)現(xiàn)BrSDG8在調(diào)控大白菜抽薹開花上發(fā)揮重要作用。【本研究切入點】雖然EMS誘變技術(shù)已在多種作物的品種選育和遺傳研究中得到廣泛應用，但目前尚無EMS誘變菜心及突變體庫構(gòu)建的相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過不同濃度EMS溶液在不同處理時間下誘變菜心高代自交系C40和小80天的種子，探討適用于菜心種子EMS誘變的最佳條件，為EMS誘變技術(shù)在菜心種質(zhì)資源創(chuàng)新中的利用提供技術(shù)支持;同時，經(jīng)EMS誘變處理，構(gòu)建菜心突變體庫，篩選菜心突變體，為拓寬菜心遺傳背景及菜心功能基因組研究和新品種選育提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

菜心高代自交系材料C40和小80天由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。C40菜心早熟，圓葉，苔高約22.0 cm，橫徑1.5～2.0 cm，播種至初收28～32 d。小80天菜心晚熟，圓葉，苔高約25.0 cm，橫徑2.0～2.5 cm，播種至初收43～46 d。主要試劑：EMS為美國Sigma公司生產(chǎn)，以pH 7的磷酸緩沖液稀釋配制;以5%硫代硫酸鈉（Na2S2O3）作為終止解毒劑;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 EMS誘變最佳處理條件篩選 于2016年10月挑選飽滿的菜心高代自交系材料C40和小80天種子，分別設(shè)4個處理濃度（0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）和3個處理時間（8、12和16 h）。每處理100粒種子，保證藥液完全淹沒種子，對照（CK）為純水處理。誘變處理后，先用5% Na2S2O3溶液沖洗種子，終止反應，再用流水沖洗種子2 h，然后播種于裝有育苗基質(zhì)的育苗盤中進行水浮式育苗，成苗后移栽至田間，按常規(guī)方法管理。統(tǒng)計并分析誘變后菜心種子的成苗率、長勢和結(jié)籽株比例等，篩選菜心種子EMS誘變最佳處理條件。

成苗率（%）=（苗期成苗株數(shù)/處理種子數(shù)）×100

結(jié)籽株比例（%）=（結(jié)籽株數(shù)/處理種子數(shù)）×100

1. 2. 2 菜心突變體庫的構(gòu)建 于2017年10月挑選飽滿的菜心高代自交系小80天種子3000粒，用0.4% EMS處理12 h，然后育苗移栽，獲得M1群體，然后對M1群體的植株進行自交授粉收獲M2群體種子。隨機選取種子量大的176份M2群體種子，挑選15粒飽滿種子作為M2群體家系，按照家系雙行條播種植，構(gòu)成M2群體。種植試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院白云試驗基地進行，按常規(guī)方法管理。以野生型菜心小80天為對照，對突變體庫M1、M2群體中單株的變異性狀進行調(diào)查。主要調(diào)查性狀為株型、薹色、葉色、葉形和花色等。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2000進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用SPSS 22.0分析出苗率和結(jié)籽株比例差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 最佳誘變條件的篩選

不同EMS處理濃度對菜心種子萌發(fā)及生長發(fā)育產(chǎn)生不同影響。0.2% EMS處理8 h后菜心種子的成苗率與CK相當，但比CK植株生長旺盛，早抽薹1～2 d，表明低濃度EMS短時間誘變對菜心種子的萌發(fā)和生長具有促進作用。隨著EMS濃度的增大，菜心種子成苗率和結(jié)籽株比例逐漸降低。當誘變處理8 h，EMS濃度為0.6%時，C40和小80天菜心的成苗率分別為65%和70%，結(jié)籽株比例為13%和31%;EMS濃度升至0.8%時，C40菜心成苗率降至50%，小80天菜心成苗率變化不明顯，結(jié)籽株比例均低于20%（圖1和圖2）。

由圖1和圖2還可看出，隨著EMS處理時間的延長，菜心種子成苗率和結(jié)籽株比例逐漸降低。EMS處理濃度為0.4%時，誘變12 h，C40和小80天菜心的成苗率均為75%，結(jié)籽株比例分別為30%和45%;誘變16 h，C40和小80天菜心的成苗率分別降至60%和55%，結(jié)籽株比例均低于20%，表明EMS誘變不僅會抑制成苗率，還會嚴重影響結(jié)實情況。當EMS濃度為0.6%、處理時間為12 h時，M1群體出苗率接近半致死，但結(jié)籽株比例低于20%，不利于突變體庫的構(gòu)建。除了盡可能提高誘變頻率外，還必須保證一定規(guī)模突變體庫的構(gòu)建，綜合比較，最終選擇0.4% EMS、誘變處理12 h為構(gòu)建菜心突變體庫的最佳處理條件。

不同基因型菜心材料對EMS的耐受性不同，C40菜心明顯弱于小80天菜心。0.4% EMS處理種子16 h，C40菜心的成苗率為60%，基本不結(jié)籽，而小80天菜心的結(jié)籽株比例為16%;0.6% EMS處理種子12 h，C40菜心與小80天菜心的成苗率相同，但C40菜心生長勢較小80天菜心弱，且結(jié)籽株比例僅5%，低于小80天菜心。不同菜心自交系材料對EMS的耐受性可能與植株的生長勢有關(guān)系，與C40菜心相比，小80天菜心植株高大強壯，根系發(fā)達。因此，生長勢強的菜心自交系EMS處理的時間或濃度可適當增大。

2. 2 菜心突變體庫M1群體表型變異

用0.4% EMS處理3000粒小80天菜心種子12 h，2019株成苗。M1群體幼苗定植于大棚網(wǎng)室，開花期套袋自交，成熟期分單株收獲種子。在M1群體中，50%以上植株不結(jié)實或結(jié)實性差，僅收獲500個單株種子。經(jīng)EMS處理的M1群體植株，長勢較CK差異明顯，主要表現(xiàn)為植株矮小，葉片黃化、白化（圖3-A和圖3-B），葉片皺縮、畸形（圖3-E和圖3-F），葉片為嵌合體（圖3-C和圖3-D），花色變化（圖3-G），叢枝（圖3-H）等變異性狀。通過對M1群體中自交后代的表型鑒定，發(fā)現(xiàn)白化、黃化、嵌合、畸形等一些變異性狀不能遺傳，可能是EMS化學藥劑傷害造成的性狀變化。

2. 3 菜心突變體M2群體性狀變異

隨機選取M1群體中種子量大的176個單株，按家系雙行條播種植，共獲得176個家系的2110個成活的M2單株，構(gòu)成M2群體。在M2群體中，全生育期內(nèi)對其表型進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)表型變異株，包括葉形、葉色、株型、花色、生育期等五大類突變。

2. 3. 1 M2群體葉片性狀突變分析 野生型小80天菜心葉色油綠、橢圓形（圖4-A）。在M2突變?nèi)后w中出現(xiàn)很多葉色和葉形的變異，如心葉黃化，隨著生長發(fā)育，葉色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檎ｎ伾蛩劳觯▓D4-B和圖4-C）;葉脈周圍葉片顏色加深或變淺，形成花葉（圖4-D和圖4-F）;葉色加深變?yōu)闈饩G色（圖4-G和圖4-H）;部分葉片皺縮（圖4-I）、卷曲（圖4-J）;有些葉片由橢圓形變?yōu)榱~形或圓形（圖4-K和圖4-L）。在M2突變?nèi)后w中，葉片顏色或形狀突變的單株共61株，變異頻率為2.8%，且葉片突變在所有表型突變中占有較高比例，占總變異性狀數(shù)的64.9%（表1）。葉片黃化或者畸形的植株大多數(shù)長勢較差，在生長的過程中逐漸死亡或難以收獲種子。

2. 3. 2 M2群體株型性狀突變分析 小80天菜心野生型株型直立、單薹、薹色油綠（圖5-A）。在M2突變?nèi)后w中發(fā)現(xiàn)一些株型變異的植株，其中典型的變異類型為葉片夾角變小，株型直立緊湊（圖5-B）;葉柄變厚變寬、肥大多汁（圖5-C）;多薹、叢生在M2突變?nèi)后w中側(cè)芽增多（圖5-D）;主薹顏色變淺、有蠟粉（圖5-E）;葉片夾角變大，株型披散、開展度變大，側(cè)芽增多（圖5-F）;植株生長緩慢，不抽薹（圖5-G和圖5-H）。在M2突變?nèi)后w中，株型變異的單株共31株，變異頻率為1.5%（表1）。

2. 3. 3 M2群體花色性狀突變分析 小80天菜心野生型花瓣為金黃色（圖6-A），在M2群體中出現(xiàn)少量花色變異，其中2株花色由黃色變?yōu)榘咨儺愵l率為0.09%（圖6-B和圖6-C）。

3 討論

EMS是一種良好的化學誘變劑，已被廣泛應用于作物誘變育種。EMS突變體庫成功構(gòu)建的關(guān)鍵是最佳誘變條件的確定。通過EMS誘變獲得突變體，多以發(fā)芽率達半致死作為選擇最佳誘變處理條件的標準。本研究以4個誘變濃度（0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）和3個誘變時間（8、12和16 h）的組合，對2個菜心高代自交系（C40和小80天）進行誘變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EMS處理除了抑制菜心種子成苗率外，還嚴重影響M1群體植株的結(jié)籽情況。這與盧銀等（2015）的研究結(jié)論較一致，即用0.4% EMS誘變處理大白菜種子，誘變1次，M1群體植株的結(jié)籽植株比例為89.1%，誘變2次，M1群體植株的結(jié)籽植株比例將為75.5%。

不同菜心材料對EMS的耐受性不同，C40菜心明顯弱于小80天菜心，可能與植株的長勢有關(guān)系，生長勢強的菜心材料EMS處理的時間或濃度可適當增大，與蕓薹屬其他作物的研究結(jié)果較一致。曲高平（2014）分別采用0.4%、0.8%和1.2%的EMS處理油菜種子，發(fā)現(xiàn)隨EMS濃度的增大，變異率先增大后減少，1.0% EMS浸種12 h是最佳誘變處理水平。盧銀等（2015）認為以0.4%的EMS浸泡種子16 h，以及連續(xù)對兩代種子進行誘變處理，均可構(gòu)建大白菜突變體庫。黃勝楠（2016）以不同濃度的EMS處理大白菜小孢子胚，發(fā)現(xiàn)隨著EMS濃度的升高，小孢子胚體的誘導率顯著下降，0.08%是EMS誘變處理小孢子胚、創(chuàng)制大白菜突變體的適宜濃度。菜心的長勢較油菜和大白菜均弱，因此誘變的濃度降低或誘變的時間縮短。菜心種子EMS誘變處理的最佳條件為0.4% EMS誘變處理12 h。同時可根據(jù)誘變材料的生長勢進行微調(diào)。

本研究采用最佳誘變條件處理3000粒小80天菜心種子，獲得了一個包含2110個單株的菜心突變體庫。在M1群體中出現(xiàn)黃化、白化、皺縮、矮化及嵌合等變異性狀，但這些變異性狀大多在M2群體中消失，推測M1群體中出現(xiàn)的某些變異性狀是由于EMS藥劑傷害所造成，不能穩(wěn)定遺傳。通過對M2群體進行分析，發(fā)現(xiàn)M2群體表型變異頻率為4.3%，突變頻率低。可能是由于突變體的鑒定局限于肉眼進行表型鑒定，且性狀調(diào)查較簡單，尚未進行品質(zhì)和抗性等重要性狀的突變體篩選，因此今后應進一步建立完善的品質(zhì)、抗性變異材料的篩選體系和評價方法，以期獲得更多有益的育種材料和更加全面地評價菜心種子EMS誘變效率和突變規(guī)律。EMS突變絕大多數(shù)是隱性突變，在M1群體中觀察不到表型變異，而需將M1群體植株自交，在M2群體中尋找突變體（李昕等，2020）。誘變后代突變體的鑒定工作量巨大，應輔之分子檢測進行篩選，提高突變體檢出效率（李浩杰等，2012）。

豐富的種質(zhì)資源是菜心遺傳育種和功能基因組學研究的重要基礎(chǔ)，有目的地創(chuàng)新種質(zhì)資源是菜心遺傳育種的關(guān)鍵任務和目標。本研究通過EMS誘變，構(gòu)建了一個包含2110個單株的菜心突變體庫。在全生育期內(nèi)對M2群體表型進行全面調(diào)查，發(fā)現(xiàn)葉形、葉色、株型和花色等突變類型，獲得緊湊株型、葉色深綠、葉柄變寬和花瓣白色等多個優(yōu)異突變體。這些突變體可作為新的種質(zhì)資源或中間材料，為新品種的培育打下基礎(chǔ)，也可用于菜心功能基因組的研究。

4 結(jié)論

利用EMS誘變菜心種子有明顯效果，構(gòu)建的菜心EMS突變體庫表型變異豐富，尤其是出現(xiàn)株型緊湊，葉色濃綠的有益突變，可用于菜心功能基因組學研究和育種。

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（責任編輯 鄧慧靈）