Gd-EOB-DTPA動態增強MRI定量評估兔肝纖維化分期的實驗研究

江錦趙，鄒立秋，張豪，鐘文新，程琳，沈新平*，楊洋

慢性肝病發展為肝纖維化(liver f ibrosis，LF)[1]，肝損傷促纖維化細胞包括肝星狀細胞等激活與增殖，進而激活肌纖維母細胞，分泌大量細胞外基質(ext racel l ul ar mat r ix，ECM)沉積于細胞外間隙，若不治療，最終發生肝硬化及并發癥[2-4]。因此檢測肝纖維化發展，早期診斷尤為重要。肝臟穿刺活檢雖然為診斷參考標準，但出血、取樣誤差等諸多缺點卻限制了臨床應用[5-6]。近年，磁共振動態增強掃描技術(dynamic cont r ast-enhanced magnet ic resonance imaging，DCE-MRI)廣泛應用于臨床檢測肝癌，許多研究者將其應用于評估LF分期[7-8]，而釓塞酸二鈉(Gd-EOB-DTPA)作為肝臟特異性MR對比劑，在掃描早期能反映慢性肝病的變化，肝膽期(注射后20 min)可以反映肝臟細胞的損傷程度[1，9]。本文旨在討論Gd-EOB-DTPA DCE-MRI定量評估兔肝纖維化早期分期的血流動力學改變的定量研究。

1 材料與方法

本實驗研究經本單位動物實驗倫理委員會批準(20170218)。

1.1 實驗動物

本實驗由廣東醫學動物實驗中心提供實驗兔及病理學檢測。200只純種、健康新西蘭大白兔，雄性、6月齡、體質量2.0 ～2.5 kg，單籠飼養(飼養溫度16～28℃、環境濕度40%～70%、晝夜間斷照明10 h∶14 h)。

1.2 建立動物模型

將100%四氯化碳(CC14液)與橄欖油(體積比1∶1)均勻混合，配成50%CC14油溶液。LF組兔每周經頸背部皮下注射50%CC14油溶液2次，第1～3周劑量約0.1 mL/kg，第4～6周劑量約0.2 mL/kg，第7～10周劑量約0.3 mL/kg。

1.3 檢查方法

采用荷蘭Phil ips Achieva 3.0 T MR掃描儀，體部線圈。掃描前實驗兔禁食12 h，肌肉注射甲苯噻嗪(0.1 mL/kg)行肌肉內注射，10 min后經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液(0.1 mL/kg)，將實驗兔置于仰臥位下，腹帶固定減輕呼吸運動。第4、5、6、15周末分別隨機選取LF組40只及對照組10只行MR肝臟軸位掃描，包括：(1)軸位T1WI(FSE)：TR/TE 185/3.3 ms，FOV 160 mm×140 mm，翻轉角15°；(2)軸位DCE-MRI(3D快速梯度回波序列)：TR/TE 126/13 ms，FOV 160 mm×140 mm，翻轉角15°；以上序列層厚4 mm，層間距0.4 mm。DCE-MRI先行兩期增強前連續脂肪抑制掃描作為每個像素的T1弛豫時間的基線，于第3期末經耳緣靜脈注射對比劑(Gd-EOB-DTPA 0.0 25 mmol/kg)，3 s內注射完成，再用生理鹽水(2 mL)沖管，連續掃描60期，每期采集16層，總時長10 min 27 s。肝膽期在注射后20 min進行掃描，掃描后耳緣靜脈注射空氣20 mL處死取肝組織進行病理學肝纖維化分期。

1.4 圖像分析

雙盲前提下，由兩名具備5年以上腹部影像診斷經驗的放射診斷醫師進行定量分析。將掃描所得Gd-EOB-DTPA DCE-MRI圖像傳輸至DCE-MRI分析軟件，采用配準技術校正，應用雙輸入-雙室Extended Tof ts藥物代謝動力學模型[10]，動脈輸入函數選取腹主動脈、靜脈輸入函數選取門靜脈主干進行勾畫ROI測量，計算生成對比劑時間-信號強度曲線，擬合獲得各定量參數偽彩圖；避開偽影，勾畫3個ROI(15～20 mm2)，并計算平均值，包括容積轉運常數(vol ume t r ansf er constant，Ktrans)、返流速率常數(ref l ux rate constant，Kep)、血管外細胞外間隙容積分數(vol ume f raction of extravascul ar extracel l ul ar space，Ve)、血漿容積分數(vol ume f raction of pl asma，Vp)。

1.5 病理學檢查

掃描后采用空氣栓塞法處死所有實驗兔，取兔肝臟并放入10%甲醛固定后制石蠟切片，行HE、Masson三色染色，采用Scheuer評分標準進行病理分期[11]，分為5期：F0：無纖維化；F1：門靜脈匯管區擴大，局限竇周、小葉內纖維化；F2：匯管區周圍纖維化或者少量纖維間隔形成，小葉結構保留；F3：大量纖維間隔、小葉結構紊亂，無肝硬化；F4：肝硬化。

1.6 統計學分析

應用SPSS 22.0 及MedCal c 18.2 .1 軟件行統計學分析，數值用±s表示。Kol mogor ov-Smirnov檢驗所有計量資料是否符合正態分布。使用單因素方差分析(one-way anal ysis of var iance，ANOVA)比較各LF分期間Ktrans、Kep、Ve、Vp的差異，組間兩兩比較采用Dunnet t’s T3法。采用Spear man相關性分析各定量參數與LF分期之間的相關性。應用ROC曲線研究各定量參數的診斷效能，包括AUC、最佳截斷值、敏感度、特異度、Youden指數和P值，采用DeLong進行各定量參數AUC的兩兩比較。P＜0.0 5為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學結果

剔除死亡、圖像質量差的實驗兔，余150只兔納入本研究，包括F0期32只、F1期32只、F2期35只、F3期30只、F4期21只(圖1)。

2.2 各定量參數分析

采用Kol mogor ov-Smir nov檢驗，Ktrans、Kep、Ve、Vp均不呈正態分布。各定量參數分布用±s表示，見表1，后處理圖像見圖2。

表1 不同肝纖維化分期兔肝臟Ktrans、Kep、Ve、Vp結果(±s)Tab.1 Summary values of DCE-MRIparameters in different LFstages(±s)

注：兩兩比較，Ktrans：在F0與F2、F3、F4組間，F1與F2、F3、F4組間，F2與F4組間差異有統計學意義(P＜0.0 5)；Kep：在F0與F2、F3、F4組間，F1與F2、F3、F4組間差異有統計學意義(P＜0.0 5)；Vp：在F1與F0、F2、F3、F4組間差異有統計學意義(P＜0.0 5)；Ve：各組間Ve差異均無統計學意義(P＞0.0 5)。

ANOVA分析：經Levene方差齊性檢驗，Kep、Vp方差齊(P＞0.0 5)，Kt rans、Ve方差不齊(P＜0.0 5)，因此Kep、Vp采用ANOVA分析。Kep在F0與F2、F3、F4組間，F1與F2、F3、F4組間兩兩比較有統計學意義(P＜0.0 5)；Vp在F1與F0、F2、F3、F4組間兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.0 5)。Ktrans、Ve進行Wel ch方差分析，Ktrans在F0與F2、F3、F4組間，F1與F2、F3、F4組間，F2與F4組間兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.0 5)；而各組間Ve差異均無統計學意義(P＞0.0 5)。各定量參數值的F值與P值見表1。

2.3 Spear man相關性分析

Ktrans與LF分期呈正相關(r=0.7 30，P＜0.0 001)；Kep與LF分期呈負相關(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；而Ve、Vp與LF分期相關性無統計學意義(P＞0.0 5)。相關關系見圖3。

圖3 Ktrans、Kep、Ve、Vp與肝纖維化分期的相關性曲線。A：Ktrans與肝纖維化分期呈正相關(r=0.7 30，P＜0.0 001)；B：Kep與肝纖維化分期呈負相關(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；C：Ve與肝纖維化分期間無相關性(r=-0.0 74，P=0.3 67)；D：Vp與肝纖維化分期間無相關性(r=-0.0 78，P=0.3 42)Fig.3 Correlational trendline graph of Ktrans,Kep,Ve,and Vp values with liver fibrosis stage F0 to F4.A:Positive correlation between liver fibrosis stage and Ktrans values(r=0.7 30,P＜0.0 001);B:Negative correlation was identified between Kep values and liver fibrosis stage(r=-0.6 17,P＜0.0 001);C:No correlation between liver fibrosis stage and Ve values(r=-0.0 74,P=0.3 67);D:No correlation between liver fibrosis stage and Vp values(r=-0.0 78,P=0.3 42).

2.4 ROC曲線分析診斷效能

ROC分析顯示Ktrans診斷效能最高，在鑒別正常肝臟與LF(F0 vs.F1～F4)、診斷早期LF(F0 vs.F1～F2)、診斷晚期LF(F0 vs.F3～F4)、鑒別早期LF與晚期LF(F1～F2 vs.F3～F4)的AUC分別為0.8 97、0.8 63、0.9 42、0.8 09，稍優于Kep(AUC分別為0.8 20、0.7 87、0.8 64、0.7 68)，Vp在鑒別各組的診斷效能較低(AUC分別為0.6 70、0.7 40、0.5 78、0.7 04)，其中在診斷晚期LF差異無統計學意義(P＞0.0 5)，而Ve鑒別各組LF的診斷效能差異無統計學意義(P＞0.0 5)。各定量參數值對LF分期的診斷效能見表2，ROC曲線兩兩比較(DeLong法)的Z值、P值分布見表3，相應ROC曲線見圖4。

表2 比較Ktrans、Kep、Ve、Vp在肝纖維化分期的診斷效能Tab.2 ROCcurve analysis of DCE-MRIparameters in different LFstages

表3 ROC曲線兩兩比較(DeLong法)Ktrans、Kep、Ve、Vp值在診斷肝纖維化分期分期的Z值、P值分布Tab.3 Comparison of ROCs(DeLong)result in the distribution of Z value and P value of DCE-MRIparameters in different LFstages

圖4 Ktrans、Kep、Ve、Vp在鑒別正常肝臟與肝纖維化(F0 vs.F1～F4)(A)、診斷早期肝纖維化(F0 vs.F1～F2)(B)、診斷晚期肝纖維化(F0 vs.F3～F4)(C)、鑒別早期肝纖維化與晚期肝纖維化(F1～F2 vs.F3～F4)(D)的ROC曲線Fig.4 ROC curve of Ktrans,Kep,Ve,and Vp in identifying LF stage between F0 and F1—F4(A),F0 and F1—F2(B),F0 and F3—F4(C),and F1—F2 and F3—F4(D),respectively.

3 討論

Gd-EOB-DTPA是肝細胞特異性MRI對比劑，在肝細胞內聚集，10 min達峰值，50%經膽道排泄；肝細胞受損，它的攝入和膽道排泄降低文獻報道慢性肝病以肝損傷后炎癥后肝臟血管形成與肝纖維化密切相關，炎癥和低氧、肝纖維化激發血管生成的主要誘導因素[12-14]。肝臟血管生成比較復雜，因肝實質具有兩類不同微血管結構，內皮細胞的粘附、遷移和作用對血管生成重要的作用，肝纖維化也不例外，阻止血管生成將成為治療肝纖維化的一種手段[15-17]。采用Gd-EOB-DTPA DCE-MRI評估肝內血管形成和肝纖維化分期的相關性及肝膽期肝細胞的損傷程度，關于肝膽期肝細胞的損傷程度與肝纖維化的相關關系將在后續研究中論述。

目前研究多應用基于時間-信號強度曲線的DCE-MRI半定量分析，多數研究采用Gd-DTPA進行DCE-MRI成像；本研究采用Gd-EOB-DTPA DCE-MRI進行定量研究肝纖維化，提取定量灌注參數Ktrans、Kep、Ve、Vp評估LF分期。Ktrans主要反映LF對比劑從血漿滲透至EES，反映內皮細胞的激活增加血管滲透性增加使發生大量ECM沉積于細胞外間隙與竇周間隙，肝竇毛細血管化，與EES間物質交換阻力增加[1-3]，理論上Ktrans隨LF進展而降低。而本研究結果顯示Ktrans與LF分期呈高度正相關(r=0.7 30，P＜0.0 001)，肝竇內皮細胞不連續，Gd-EOB-DTPA可穿透肝竇內皮細胞膜進行轉運，肝纖維化后肝竇毛細血管化后造成肝竇壓力增高，門靜脈壓力增高、血流減緩，局部肝動脈血流灌注分數代償性增高或可加速Ktrans轉運，并且EOB基團能轉運至肝細胞內等因素使Ktrans升高，而Liu等[18]、Li等[19]、Zhang等[20]、Ji等[21]研究兔CC14LF模型結果也顯示Ktrans與LF分期呈正相關。ROC分析顯示Ktrans能診斷早期LF(AUC=0.8 63)，診斷晚期LF(AUC=0.9 42)，能較好鑒別早期(F1～F2)LF與晚期LF。

Kep反映對比劑從EES返流至血漿的速率，肝竇毛細血管化、肝竇、門靜脈高壓，血流速度減緩，Kep理論上應該下降(r=-0.6 17，P＜0.0 001)；Kep在診斷早期LF(AUC=0.7 87)、診斷晚期LF(AUC=0.8 64)、鑒別早期LF與晚期LF方面稍次于Ktrans；但是DeLong法結果顯示兩者差異并不顯著(Z＜1.9 6，P＞0.0 5)。

Ve指血管外細胞外間隙容積分數，Vp反映細胞外血漿容積，本實驗結果顯示與LF分期間的無明顯相關性(P＞0.0 5)，LF病理EES可因膠原纖維沉積、局部炎癥、水腫等而增寬，隨LF進展Ve先稍下降，晚期Ve升高；ECM早期沉積于EES或許不能造成Ve明顯上升，而肝竇毛細血管化、促纖維化細胞增殖、纖維增生破壞肝組織等原因也可能讓流入EES的對比劑減少，導致Ve下降。LF發生肝內小血管阻塞，肝竇毛細血管化，門靜脈高壓，血管短路、肝動脈血流代償性增加，肝臟整體血流灌注下降等一系列血流動力學異常，或許是造成Vp無法準確評估LF的重要因素[22]。

本研究的局限性：(1)兔CC14LF模型不同于人類慢性肝病，病理、血流動力學改變仍有區別；(2)肝臟鐵沉積、炎癥、脂肪沉積等對定量參數的影響未能完全除外；(3)Gd-EOB-DTPA DCE-MRI診斷LF的研究較少，藥物代謝動力學模型匹配性與各定量參數準確性仍待考究。

總之，Gd-EOB-DTPA DCE-MRI通過獲得定量參數，尤其是Ktrans為無創性評估肝纖維化分期提供重要的診斷手段。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。