不同激素對甘草帶芽莖段誘導叢生芽的影響

付 麗，張東向，劉安奇，呂 晴，李 偉

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

甘草（Glycurrihiza uralensisFisch.）為豆科甘草屬多年生草本植物［1］，是最常用的藥用植物資源之一，其根莖入藥，具多種藥理活性，有廣泛的藥用和商業價值［2］。近年來國內外市場對甘草的需求日益增加，甘草野生資源面臨過度開采和枯竭的威脅［3］，質量和產量急劇下降，種質資源遭到嚴重破壞。隨著科技的不斷發展和應用，利用甘草組培技術進行快繁已有大量研究。汪連海等［4］采用不同激素配比的培養基，以甘草無菌苗莖尖為材料進行快繁研究，成功優化出增殖培養基，建立甘草快繁體系，甘草組織培養技術不僅有利于繁殖、增殖和保存，而且有利于誘導次級代謝產物的產生［5］，為甘草有效成分的提取奠定基礎。而利用帶芽莖段誘導叢生芽具有穩定的遺傳性［6］，魏曉雪等［7］對野生興安百里香進行快繁研究，證明帶芽莖段為興安百里香組培的最佳外植體，因此本試驗采用甘草無菌苗的帶芽莖段為材料，將無菌苗帶芽莖段接種在不同激素含量的培養基中誘導叢生芽，通過測量植株株高、莖節段數、真葉片數及叢生芽的增值倍數等，以確定最佳的培養條件，研究最佳的植物激素濃度組合，確定甘草帶芽莖段誘導叢生芽最佳培養基配方，以期為甘草快繁技術的應用提供理論指導及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

經專家鑒定為當年生甘草的無菌苗帶芽莖段。

1.2 方法

本試驗于2019年4月于齊齊哈爾大學生命科學與農林學院植物代謝生理研究室進行。

1.2.1 處理方法 在無菌條件下，選擇正常生長20 d、茁壯、有節段的無菌苗，在超凈工作臺上用滅菌鑷子取出，置于事先經高壓滅菌干燥冷卻后的濾紙上，用滅菌解剖刀和鑷子取其帶芽莖段0.7 cm，放入不同激素處理的培養基內，每瓶接種4個帶芽莖段，封口后放入恒溫培養箱內培養，溫度為25℃，光照2 000 lx。

1.2.2 試驗設計 根據培養基中6-BA、KT和NAA的濃度比進行單因素和組合因素設計相應適合叢生芽誘導的培養基。培養基中均加入30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂，單因素設計：①MS+6-BA（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；②MS+KT（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；組合因素設計如表1和表2所示，每組設置3個平行試驗，每瓶25 mL培養基。

表1 不同濃度6-BA和KT組合設計

表2 不同激素組合試驗設計

1.2.3 數據統計 接種20 d后觀察帶芽莖段誘導叢生芽及愈傷組織生長情況，按照下列方法計算叢生芽增值倍數和愈傷組織誘導率。

叢生芽增值倍數=分化出叢生芽個數/接種帶芽莖段數量；愈傷組織誘導率=（形成的愈傷組織塊數/接種外植體數）×100%。

2 結果與分析

2.1 6-BA對帶芽莖段叢生芽誘導的影響

2.1.1 不同濃度6-BA對帶芽莖段生長的影響 由表3可知，6-BA濃度為0.2和1.4 mg/L時均沒有叢生芽產生；MS+1.8 mg/L 6-BA對帶芽莖段株高影響最大，為（10.40±0.26）cm，與其他濃度存在極顯著差異；MS+1.8 mg/L 6-BA的帶芽莖段節段、節間距、真葉數分別為（5.67±1.15）節、（1.66±0.15）cm、（6.67±1.15）片，表明6-BA濃度為1.8 mg/L對甘草壯苗最為有利。

表3 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽生長的影響

2.1.2 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表4可知，MS+0.2 mg/L 6-BA沒有叢生芽產生；6-BA濃度為0.6 mg/L時，其叢生芽的增值倍數為2.67±0.53；MS+2.2 mg/L 6-BA叢生芽增值倍數為3.00±0.20，且每個叢生芽均有1～2片真葉，6-BA濃度在1.0～2.2 mg/L，隨6-BA濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數升高。

表4 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

2.1.3 不同濃度6-BA對帶芽莖段愈傷組織形成的影響 不同濃度的6-BA對甘草帶芽莖段誘導愈傷組織生長發育有一定影響，由表5可知，6-BA濃度在0.2和0.6 mg/L的培養基中，愈傷組織的生長狀態良好且褐化率分別為11.11%和33.33%，6-BA濃度在1.0～2.2 mg/L褐化率 依次為33.33%、66.67%、44.44%、55.56%；隨6-BA濃度的升高，愈傷組織有褐化趨勢；但6-BA濃度在0.2～2.2 mg/L出愈率均達到100%。

表5 不同濃度6-BA對甘草帶芽莖段誘導愈傷組織形成的影響

2.2 不同濃度KT對甘草帶芽莖段叢生芽誘導的影響

如表6所示，在本試驗所設的6個KT濃度下（0.2～2.2 mg/L）甘草帶芽莖段均沒有長叢生芽，但卻有根和愈傷組織生成。表明不同濃度的KT對甘草帶芽莖段生長發育影響較大，KT為2.2 mg/L時甘草帶芽莖段植株高度達（9.30±1.35）cm，與其他濃度存在極顯著差異；而且莖節數可達（4.75±0.71）個，與KT 1.4和1.0 mg/L存在極顯著差異，和其他濃度之間沒有顯著差異；MS+2.2 mg/L KT真葉為（5.25±1.04）片，與KT 1.0 mg/L存在極顯著差異，與其他濃度沒有顯著差異，說明KT不利于誘導叢生芽。

表6 不同濃度KT對甘草帶芽莖段叢生芽誘導的影響

2.3 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段叢生芽誘導的影響

2.3.1 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段生長的影響不同濃度的6-BA+KT對甘草帶芽莖段生長發育的影響見表7，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT對帶芽莖段株高影響最大，株高可達（8.63±1.21）cm，莖節數也可達（4.67±0.58）個/株，同時，該組合還對提高真葉片數最為有利。但就促進節間伸長而言，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT的影響最大，可達為（1.90±0.23）cm。對愈傷組織誘導而言，0.9 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT最為有利，愈傷半徑高達（0.37±0.13）cm，因此綜合來看，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT對甘草壯苗有利。

表7 不同濃度6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽誘導的影響

2.3.2 不同6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表8可見，不同6-BA和KT配比對甘草帶芽莖段誘導叢生芽生長發育具有一定影響，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT對叢生芽增值倍數誘導最高，為（2.00±0.00）倍，與0.8 mg/L 6-BA+1.2 mg/L KT存在顯著差異，與其他濃度無差異；對叢生芽高度誘導，為（2.78±0.37）cm；叢生芽節間距為（1.50±0.27）cm；誘導叢生芽真葉為（1.33±0.13）片，與其他濃度均無差異；說明0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT為誘導叢生芽的增值倍數較適合的濃度。

表8 不同6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響

2.3.3 不同6-BA+KT組合對帶芽莖段愈傷組織形成的影響 由表9所示，不同濃度6-BA+KT對甘草帶芽莖段愈傷組織形成具有顯著影響，在6-BA+KT的5個組合中，雖然均能誘導出愈傷組織，但長勢都不理想，愈傷組織大多都褐化趨于黑色，當帶芽莖段接種到6-BA+KT組合培養基中，6 d左右帶芽莖段底端膨大，出現水樣化，愈傷組織有生長跡象，在13 d左右莖段底部有淡黃色水樣化愈傷組織，連續培養16 d左右愈傷偏淺褐色，最后褐化甚至變黑色。

表9 不同濃度6-BA+KT組合對甘草帶芽莖段愈傷組織形成的影響

2.4 不同激素組合對甘草叢生芽增值倍數的影響

由表10可知，不同濃度的6-BA、KT和NAA及其組合對甘草帶芽莖段誘導叢生芽有影響且存在一定差異，綜合上述試驗，適合甘草帶芽莖段叢生芽誘導的平均增值倍數（≥3）的激素組合為MS+2.2 mg/L 6-BA、MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，其中MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT叢生芽的平均增值倍數達到（5.00±1.61）倍。

表10 不同激素組合對甘草叢生芽增值倍數的影響

3 討論

試驗把甘草帶芽莖段分別接種在不同激素組合的培養基中，在誘導培養階段發現，僅添加6-BA的培養基誘導率較高，適宜的6-BA濃度可顯著促進叢生芽的形成，此結果與王效宇［8］在隨6-BA濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數升高的結論一致。高濃度的6-BA對芽生長有抑制作用，與王非等［9］在6-BA濃度對褐毛鐵線蓮帶芽莖段誘導叢生芽中，適宜的6-BA濃度促進褐毛鐵線蓮帶芽莖段叢生芽的形成，高濃度對叢生芽生長有抑制作用的結果相一致。在僅添加KT的培養基中沒有叢生芽的產生，但對帶芽莖段的生長發育有顯著影響。本試驗在6-BA和KT組合中發現，隨著KT濃度的逐漸升高，叢生芽增值倍數有下降趨勢，與梁昊［10］在KT濃度升高對千層塔叢生苗生長有抑制影響，且較高濃度均會對叢生苗的生長產生抑制作用，甚至死亡的結論一致。在只有6-BA的培養基中愈傷有褐化情況，而當加入KT之后，隨著濃度的增加愈傷組織不僅均趨于褐化而且出現黑色愈傷。進一步說明在6-BA與KT組合時，同時增加6-BA和KT的濃度對愈傷組織體積的狀態沒有很大的改變，但對愈傷組織的生長狀況有抑制的趨勢［11］。

大量研究表明，適宜的生長素和細胞分裂素組合可有效誘導植物外植體分化與生長，于紅梅等［12］在以海沃德獼猴桃帶芽莖段為外植體直接誘導叢生芽，建立快繁體系中發現，不同配比生長素與細胞分裂素對叢生芽誘導影響顯著。試驗發現不同激素組合對甘草帶芽莖段誘導叢生芽生長有不同程度的影響，在甘草外植體誘導分化叢生芽的生長周期內，帶芽莖段誘導叢生芽優化培養的適宜培養基是MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。莖段能否進行芽增值受到多種因素的影響，叢生芽增殖率高低很大程度上取決于一定范圍內細胞分裂素與生長素的配比［13］，細胞分裂素水平增高，增進芽發育，易形成叢生芽。因此，在叢生芽的誘導過程中，細胞分裂素和生長素的配比是非常重要的［14］。