麻城油茶體細胞胚胎發生及植株再生

龐芳芹，張靖怡，柳 倩，湯欣欣，胡孝明，朱華國

（黃岡師范學院生物與農業資源學院/經濟林種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000）

油茶是山茶屬（Camellia）植物中種子含油率較高樹種的統稱，也是中國特有的木本油料樹，油茶與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料作物［1］。茶油的不飽和脂肪酸含量高達90%，遠遠高于菜油、花生油和豆油，維生素E含量比橄欖油高一倍，并含有山茶甙等特定生理活性物質，具有極高的營養價值［2］。同時，油茶林是良好的生態林，油茶也是農林業產業結構調整、精準扶貧的重要經濟作物，發展油茶產業具有很高的經濟效益、社會效益和生態效益［3］。

1979年，中國第一次開展油茶組織培養試驗，顏慕勤等［4］通過試管對下胚軸進行培養，獲得第一批完整植株。而后，顏慕勤［5］以人工誘導油茶體細胞胚狀體試驗獲得成功，并對油茶體細胞胚狀體的發生進行了連續切片觀察，發現油茶體細胞胚狀體是從子葉基部分化而來。隆振雄［6］和盧天玲［7］先后分別利用油茶未成熟子葉幼胚離體培養獲得再生植株。李建安等［8］對紅花油茶的花藥進行離體培養，并誘導形成愈傷組織。畢方鋮等［9］對油茶的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進行誘導獲得再生植株。截止目前，油茶組織培養方面取得了較多進展［10-13］，但尚未建立以體細胞胚胎發生為基礎的遺傳轉化技術體系，可能與油茶以體細胞胚胎發生方式獲得植株再生效率低有關。

中國食用油消費量巨大，但目前自給率不足40%，嚴重影響了中國的糧油安全［14］。發展油茶產業，開發山地空間，不僅不會出現與糧食爭地的問題，還能提高國土資源使用效率，使國家糧油安全得到保障［15］。湖北省麻城市位于大別山區中段南麓，油茶種植歷史悠久，資源豐富［16，17］。隨著生產發展和社會需求的不斷提高，生產上對油茶品種的產量、品質、抗性等提出越來越高的要求，這些問題的解決僅依靠傳統育種手段已無法滿足［18，19］。建立以體細胞胚胎發生方式獲得再生植株的技術體系，可為建立油茶以農桿菌介導的遺傳轉化技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年7月中旬，取自湖北省麻城市（東經114°40′—115°28′，北緯30°52′—31°36′）成熟油茶林優良單株上性狀良好、無病蟲害的油茶果實，并做好標記。茶果置于4℃冰箱保存，3 d內完成消毒接種。

1.2 方法

徒手剝去油茶果實果皮，放在75%乙醇表面消毒2 min，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4次，剝掉內種皮。在無菌條件下將幼胚切塊，每個幼胚切成3～5塊，接種于90 mm培養皿中，每皿接種7～9個外植體。誘導培養基設置兩種組合，均以MS為基礎培養基，分別附加2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+1.0 mg/L KT和5.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，pH調至5.8，用于愈傷組織誘導。1個月后，2種處理的愈傷組織誘導率分別為83.23%和45.35%，將生長良好的愈傷組織繼代至分化培養基（MS培養基附加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，pH調至5.8）進行分化調控。繼代2次后，胚狀體平均發生率為15.25%。將出現胚狀體的外植體轉入胚狀體發育培養基（MS培養基+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，pH調至5.8）中繼續培養。直至獲得具有明顯子葉的胚狀體后，轉至生根培養基（1/2 MS+3.0 mg/L 6-BA，pH調至5.8）培養。獲得具備根和芽的完整植株后，馴化并轉移至營養缽內繼續生長。以上每處理18皿，重復3次，均在28℃培養箱中進行，光照16 h/d，光照度為2 500 lx，30 d左右繼代1次。愈傷組織誘導率=愈傷組織塊數/接種外植體數×100%，胚狀體發生率=胚狀體數/接種愈傷組織塊數×100%，結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對幼胚愈傷組織誘導的影響

取7月中旬未成熟幼胚，消毒后每個幼胚用手術刀切成3～5塊，接種于2種不同誘導培養基中進行愈傷組織誘導（圖1A）。1個月后，可見外植體邊緣出現明顯的愈傷組織。2，4-D+KT組合誘導產生結構疏松、顏色淺而透明的愈傷組織（圖1B、圖1C），而NAA+KT組合則誘導出結構緊密、綠色的愈傷組織（圖1D、圖1E），部分幼胚塊長出少量愈傷組織的同時長出明顯的根狀物（圖1F）。

圖1 油茶的愈傷組織誘導

2.2 愈傷組織的分化與胚狀體形成

選擇結構疏松的愈傷組織轉入分化培養基進行培養，經過2～3個月的培養，愈傷組織顏色逐漸加深，產生肉眼可見的胚狀體，白色、綠色和淡黃色胚狀體呈簇形成（圖2A、圖2B、圖2C）；部分形成了根狀物的愈傷組織中也有少數形成了胚狀體（圖2D），表明2種不同的激素組合處理形成胚狀體的方式不同。

圖2 油茶愈傷組織的分化及胚狀體發生

2.3 胚狀體發育及植株再生

將胚狀體繼代到胚狀體發育培養基繼續培養，可見部分胚狀體進一步發育形成了具備完整子葉的個體（圖3A、圖3B）。將胚狀體進行生根培養后，可以形成肉眼可見的根系，經過馴化后移栽至營養缽可以進一步生長（圖3C、圖3D）。

圖3 油茶的胚狀體發育及植株再生

3 討論

以7月中旬麻城油茶幼胚為外植體進行組織培養，經過愈傷組織誘導、胚狀體分化、發育、生根過程后，可以獲得具備根和芽的完整植株，建立了6個月內獲得麻城油茶通過體細胞胚胎發生方式獲得再生植株的技術體系。愈傷組織誘導階段發現MS培養基附加2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT激素能夠有效誘導愈傷組織，后期通過更換生長素類型能較好地促進胚狀體的分化和發育，與其他很多植物組織培養中的過程類似，表明生長素對于油茶的體細胞胚胎發生具有較大的影響。此外，在胚狀體分化階段，嘗試過低濃度NAA處理，發現當濃度過低時愈傷組織會大量死亡，而NAA濃度上升到1.0 mg/L時，褐化效果得到明顯改善。由于植物組織培養受基因型限制，不同的油茶品種必然出現不一樣的表現，本研究所建立的體細胞胚胎發生及植株再生體系是否適應于其他油茶品種還需要進一步驗證。