HPGD基因表達量與絕經后骨質疏松癥的關系探討

劉楓秀 劉言言 袁璧釵 邱楚佳 楊川

骨質疏松癥是一種與年齡相關的骨骼疾病,主要是以單位體積骨量減少,導致骨脆性增加,從而易于發生骨折為特征。流行病學調查顯示,目前,全世界約有2 億人患骨質疏松癥［1］,而我國在過去12 年中骨質疏松癥的患病率明顯增加(2008 年以前患病率為14.94%,2012～2015 年期間患病率為27.96%),其中女性患病率明顯高于男性(25.41% VS 15.33%)［2］。因此,提高絕經后骨質疏松癥防治的水平意義重大。研究表明,絕經后骨質疏松癥及其骨折的發生是遺傳因素和非遺傳因素相互作用的結果,雙生子及家系研究表明,骨密度的變異50%～85%是由遺傳所決定的［3］。隨著遺傳變異逐漸認識其在骨質疏松癥發病過程的重要性,絕經后骨質疏松癥的遺傳學已經成為骨生物學研究最為活躍的研究領域之一。厚皮性骨膜病是一種以皮膚增厚、回狀顱皮、骨膜肥厚、關節腫脹、杵狀指(趾)為臨床特征的遺傳性骨代謝疾病,HPGD 基因突變被證實其通過改變下游因子前列腺素E2(PGE2)濃度起而成為該病的致病原因［4］,而PGE2也是骨質疏松癥發病過程中重要的調節因子,而關于HPGD 基因表達與骨質疏松癥的關系,目前尚無相關報道,本研究通過測定實驗組及對照組HPGD 基因表達水平,探討HPGD 基因表達量與絕經后骨質疏松癥的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集揭陽市人民醫院內分泌科 2019 年4 月～2020 年2 月住院的54 例絕經5 年內女性患者作為研究對象,經DAX 檢測骨密度,將L1～2T 值≤-2.5 確診為絕經后骨質疏松癥的患者作為實驗組(20 例),L1～2T 值>-2.5 確診為非骨質疏松癥患者作為對照組(34 例)。所有研究對象均為無血緣關系的漢族人群。排除標準：排除嚴重肝腎功能不全、嚴重心腦血管疾病、惡性腫瘤、其他系統嚴重器質性病變及服用影響骨代謝的藥物,排除其他繼發性骨質疏松癥。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集和生化指標測定 所有患者為絕經后5 年內女性患者,記錄患者的年齡、身高、體重,計算體質量指數(body mass index,BMI)：體重(kg)/身高(m)2,記錄吸煙、飲酒情況。受檢者空腹8 h 以上,清晨采集靜脈血,用奧林巴斯AU400 全自動生化儀檢測FBG、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.2 性激素6 項測定 清晨空腹抽取所有患者外周血2 ml,離心提取血清,采用放射免疫法測定E2、孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、促卵泡刺激素(FSH)、雄激素(T)、泌乳素(PRL)。

1.2.3 骨代謝生化指標及骨密度測定 采用全自動生化分析儀測定所有患者的Ga、IP、ALP、PTH 等骨代謝生化指標；應用法國DMS 公司生產的雙能DAX 檢測患者腰椎前后位骨密度,自動測出T 值,骨密度檢測人員為經過專門培訓的同一個技術人員。

1.2.4 HPGD 基因表達水平檢測

1.2.4.1 提取人外周血單個核細胞(PBMC)取3 ml裝于乙二胺四乙酸(EDTA)管中的人外周全血,按順序加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等比例稀釋,混勻,稀釋后的人血(6 ml)沿管壁緩慢加入裝有淋巴細胞分離液(3 ml)的試管中,保持淋巴細胞分離液與人血界面明顯,離心(420 r,30 min),可見分為四層,血清與淋巴細胞分離液之間的不透明層,即為PBMC,移至新試管中,加入PBS(3 倍PBMC 體積),吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液,加入2 ml 的紅細胞裂解液,吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液,加入5 ml 的PBS,吹勻,離心(1000 r,5 min),棄上清液。

1.2.4.2 RT-qPCR 檢測HPGD 基因表達水平 按照RNAiso Plus 試劑說明書(TAKAR,貨號9109) 提取PBMC 總RNA,逆轉錄成cDNA(TAKARA 貨號RR036A),以Actin 作為內參,RT-qPCR(型號Roche LightCycler 480 Ⅱ) 檢 測HPGD 基因表達水平,用2-ΔΔCt統計方法分析所有患者HPGD 基因表達水平。RT-qPCR 反應條件：95℃預變性5 min,95℃變性10 s,60℃延伸40 s,共40 個循環。引物設計后外送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行合成,序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.3 觀察指標 比較兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2、骨密度T 值及HPGD 基因表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 ()表示,采用t 檢驗；RT-qPCR 分析時,用2-ΔΔCt統計方法分析HPGD 基因相對表達量的差異。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2及骨密度T 值比較 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2比較,差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組骨密度T值明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2 及骨密度T 值比較()

表2 兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2 及骨密度T 值比較()

注：與對照組比較,aP<0.05

2.2 兩組HPGD 基因表達量比較 實驗組HPGD 基因表達量(1.079±1.190)明顯低于對照組的(2.349± 3.131),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。這表明絕經后骨質疏松癥患者HPGD 基因表達顯著下調,該基因在絕經后骨質疏松癥的發病過程中可能起到某種調控作用。

圖1 兩組HPGD 基因表達水平比較

3 討論

2008 年,英國Uppal 等首次在厚皮性骨膜病家系中鑒定到HPGD 基因純合突變,并證實該基因突變是該病的致病原因［4］。HPGD 基因位于染色體4q34.1,長度為31kb,由7 個外顯子組成,并編碼催化酶15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)［5］,該酶通過催化PGE2脫氫生成酮基前列腺素(PGE-M),從而促進前列腺素分解代謝,降低PGE2濃度［6］。厚皮性骨膜病患者因HPGD基因突變,使編碼的15-PGDH 蛋白酶喪失正常功能,不能催化PGE2降解,體內PGE2長期慢性增高,導致細胞因子相關的血管擴張和組織重建,并促進成骨細胞和破骨細胞的活性,產生一系列骨膜炎、肢端骨質溶解和骨質增生,最終出現厚皮性骨膜病的病理特 征［7］。

PGE2是一種重要的骨代謝調節因子,在成骨細胞和破骨細胞中均存在受體,不同的受體通過不同的信號通路對骨質疏松起到雙重作用,一方面可促進骨形成,另一方面可促進骨吸收,其發揮的作用主要取決于存在的環境條件。本研究檢測了絕經后骨質疏松患者(實驗組)和非骨質疏松患者(對照組)的臨床生化、性激素、骨代謝、骨密度T 值等臨床指標,結果顯示,兩組年齡、FPG、Ca、IP、ALP、PTH、E2比較,差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組骨密度T 值明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組HPGD 基因表達量明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。從而影響下游因子的PGE2的表達水平,而PGE2的生物活性與4 個G 蛋白藕連受體前列腺素E 受體1(EP1)、前列腺素E 受體2(EP2)、前列腺素E 受體3(EP3)、前列腺素E 受體4(EP4)有關［8］。PGE2通過與EP1結合,使Ca2+內流,激活蛋白激酶C(PKC)通路,導致成骨細胞增殖［9］,另外可促進大鼠原代成骨細胞纖維連接素的表達［10］,還可以通過調控縫隙連接蛋白的生成及轉運,使細胞之間的信息傳遞增加,進而提高去分化脂肪細胞向成骨細胞分化的速度,加快了成骨細胞的成熟還有骨質的重建［11］,從而起到抗骨質疏松作用。另外,PGE2可通過激活多個信號通路誘導護骨素(OPG)同源配基核因子-κB 受體激活物配基(RANKL) mRNA 表達,促進破骨細胞生成［12］,抑制OPG mRNA 的表達［13］,引起 RANKL/OPG 的相對表達增加,促進破骨細胞的分化、成熟和破骨細胞骨吸收。體外研究表明,PGE2可通過EP2抑制由PTH 刺激的骨髓間充質干細胞成骨細胞分化,從而抑制PTH 的成骨作用,而使骨量降低［14］。

綜上所述,HPGD 的表達量與絕經后骨質疏松癥具有一定的相關性,HPGD 基因低表達可能使絕經后的女性患者罹患骨質疏松癥的風險升高。但本研究樣本量少,且缺乏對下游因子的進一步研究,后續將進一步探討HPGD 基因在絕經后骨質疏松癥調控過程中可能的信號通路。