鐘基因在炎性腸病中的免疫調控研究進展*

秦青華， 邱春紅

（山東大學齊魯醫學院基礎醫學院細胞生物學系，山東濟南250012）

炎性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）的發病率在中國呈現逐年上升的趨勢，而且其難以治愈及反復發作的特點具有惡化為結直腸癌癥的風險。目前，對于IBD 的主要藥物治療策略可分為兩類：（1）用抗炎類藥物進行治療，例如5-氨基水楊酸［1］；（2）免疫抑制劑療法，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制劑［2］。這兩種治療方法雖然可以有效的抑制IBD，但仍然不能從本質上起到治愈IBD 的作用。此外，長期使用抗炎藥物易致使機體產生耐藥性，而免疫抑制劑可導致機體產生免疫紊亂從而影響治療效果。因此，明確疾病的發病機制、探索更為有效的治療方式成為臨床和基礎研究急需解決的問題。

時鐘基因的節律性表達在正常生命活動中普遍存在，并通過參與調控外周生物鐘與中央生物鐘正常運轉實現各器官功能的調控［3］。已有相關研究表明時鐘基因可以參與免疫調控過程進而干預炎癥疾病的發生發展［4］，從鐘基因的角度探究IBD 的發病機制并開發非藥物依賴性的物理治療手段干預腸道疾病具有重要的臨床意義。因此，本文綜述鐘基因與炎癥免疫的相關研究，為IBD 的臨床診治提供參考資料。

1 鐘基因基本調控機制

晝夜節律的紊亂與臨床多種疾病有關［5］。生物鐘作為機體產生節律行為的內在因素主要由輸入通路、中央振蕩器和輸出通路3 個部分組成，通過分子水平反饋環路和信號級聯放大機制實現機體生理和行為活動產生周期性變化，從而維持機體器官與內外界環境變化相適應并發揮正常生理功能［6］。

截止目前，已報道的哺乳動物鐘基因主要包括以下幾種：Per1、Per2、Per3（period circadian genes）；Cry1、Cry2（cryptochromes）；Bmal1（brain and muscle ARNT-like 1）；Rev-erbα、Clock（circadian locomotor output cycles kaput）、Dbp（D-site binding protein）和Nfil3（nuclear factor，interleukin 3 regulated）。這些基因的轉錄翻譯活動構成哺乳動物中的3條轉錄-翻譯反饋環路（圖 1）：（1）正調控蛋白 CLOCK 和BMAL1 通過bHLH-PAS 結構異二聚化結合到負調控基因（Cry1、Cry2、Per1和Per2）的E-box 上，從而激活基因轉錄；其表達產物鐘蛋白CRY 和PER 達閾值后，二者相互作用（CRY-PER）從胞漿轉移至核內，進而抑制Clock和Bmal1的轉錄，阻斷BMAL1-CLOCK異二聚體的形成［7］。（2）BMAL1-CLOCK 異二聚體促進Rorα/β/γ［8］和Rev-erbα/β［9］基因的表達；RORα/β/γ和 REV-ERBα/β 蛋白與Bmal1啟動子的反應元件RORE 結合而發揮促進或阻遏Bmal1基因轉錄的作用［10］。（3）BMAL1-CLOCK 異二聚體啟動Dbp基因的表達產生DBP 蛋白：一方面，DBP 可與帶有D 盒的基因（如Rorα/β/γ）結合并激活其轉錄；另一方面，NFIL3 蛋白也能夠競爭性結合至D 盒而抑制相關基因表達。此外Nfil3基因本身也作為 RORα/β/γ 的靶基因而受到調控［11］。這3條轉錄-翻譯反饋環路通過控制鐘基因的表達，進而調節哺乳動物的節律，維持各器官生理功能的穩定。

Figure 1.Transcriptional-translational feedback loop of clock genes.圖1 鐘基因的轉錄-翻譯反饋環路

2 鐘基因與炎癥性腸病的關系

克羅恩病（Crohn disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD 的兩種主要類型。IBD患者如不能進行及時、有效治療，約三分之一的結腸炎患者會發生癌變［12］。因此，進一步明確IBD 的發病機制、防止其惡化，并提供更加行之有效的治療方法是臨床治療和基礎醫學研究中所要解決的重要問題。

腸道免疫細胞、細胞因子、腸道菌群等被證明與內部時鐘密切相關。這些因素一方面受到鐘基因的調控呈現晝夜變化，另一方面也干擾鐘基因的表達［13］，例如Bmal1、Rev-erbα等鐘基因能夠參與調控細胞分化、脂質代謝、線粒體生物發生和炎癥等各種生理病理過程。因此，以生物鐘系統調節機體免疫反應或將成為治療腸道炎癥疾病的一種新方法［14］。

2.1 鐘基因調控固有免疫細胞參與炎癥反應 特定的固有免疫細胞亞群對IBD 的發生發展發揮著關鍵調控作用［15-17］。單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞等多種固有免疫細胞［18］已被證明具有內在的“時鐘機制”，這些“時鐘”影響細胞的功能，如調節巨噬細胞吞噬活性、細胞因子釋放、抗病毒活性、肥大細胞的組胺釋放、過敏反應等［19］，是調節固有免疫細胞發揮作用的關鍵因素。

周期性蛋白PER1是脾臟NK細胞發揮有效功能所必需的［20］，而在巨噬細胞中含有Bmal1 的時鐘轉錄因子網絡能夠通過調控增強子的表觀遺傳狀態來控制巨噬細胞的炎癥反應［21］。髓系來源的細胞在干擾Bmal1 后抑制了核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的轉錄，進而促進白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的產生［22］，加重炎癥反應。

NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）炎癥小體是由NLRP3、ASC 和caspase-1 組成的大蛋白復合物［23］，在對病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的先天免疫反應中起著核心作用［24-25］。巨噬細胞中激活的NLRP3 炎癥體促進caspase-1、促炎細胞因子IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌，而這一過程同樣也受到REV-ERBα的嚴格調控［26］。此外，巨噬細胞中Bmal1的敲除可上調丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）蛋白水平并促進乳酸產生，最終導致免疫檢查點蛋白程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）高表達［27］。

隱花色素（cryptochromes，CRYs）通過對腺苷酸環化酶的作用直接影響炎癥通路。在敲除Cry1的情況下，cAMP 的基礎水平升高導致蛋白激酶A 激活增強，進而誘導p65 亞基S276 位點磷酸化，促進NF-κB信號通路激活。Cry1-/-Cry2-/-小鼠的巨噬細胞、成纖維細胞和骨髓細胞中幾種促炎細胞因子，如IL-6、TNF-α 和 CXC 趨化因子配體 1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）的基礎水平升高［28］。

中性粒細胞被募集至利什曼原蟲感染位點也已被證明受到鐘基因的調節［29］；Godinho-Silva 等［30］證明，第3 組固有淋巴樣細胞（group 3 innate lymphoid cells，ILC3s）內也存在生物鐘。

2.2 鐘基因調節適應性免疫細胞的發育及遷移 早期人們認為適應性免疫從激活到發揮作用再到結束的整個過程發生速度較快，因而不受生物鐘的調控。近些年分子水平的研究表明淋巴細胞的發育分化及功能發揮同樣受到生物鐘的調控［31］。

2.2.1 BMAL1 與淋巴細胞的發育 鐘基因參與B淋巴細胞的發育機制尚不明確，但淋巴細胞發育的晝夜節律調節對于每天維持細胞類型的平衡至關重要。Bmal1-/-小鼠血液和脾臟中B 細胞數量明顯減少，過繼轉移實驗表明阻礙B細胞分化的不是B細胞的內在“時鐘”，而是骨髓微環境中BMAL1 的缺失［32］。關于生物鐘對T 細胞發育的影響，研究認為總的T 細胞數目不受整體或細胞特異性Bmal1敲除的影響［33］。

2.2.2 NFIL3 與T 細胞的發育 轉錄因子NFIL3 又稱E4BP4，在多種免疫細胞中表達并可調節多種細胞類型不同的免疫功能，而Nfil3轉錄同樣受細胞生物鐘控制［11］。在活化的Rev-erbα-/-CD4+T 細胞中，NFIL3 的表達通常高于未敲除Rev-erbα的 CD4+T 細胞［9］。NFIL3 通過節律性抑制Rorc的轉錄以實現對TH17 細胞的調節（Rorc編碼的 RORγt 是 TH17 所必需的關鍵轉錄因子）；細胞分化研究發現，NFIL3在白天表達較低，夜間表達較高，RORγt 在白天表達較高，夜間表達較低，因此白天分離的純CD4+T細胞在體外極化后更容易分化為TH17細胞［34］。

在Nfil3-/-小鼠中ILC3s 發育受阻，從而導致TH17細胞的分化受到抑制［35］。但這一差異在Nfil3-/-細胞中是不存在的，這表明體內TH17細胞的數量平衡是依賴NFIL3的，并通過生物鐘在整個T細胞群體中同步進行。也有研究表明，夜間信號激素褪黑素的水平較低會影響TH17 細胞的分化，褪黑素對人T細胞的治療已被證明可以通NFIL3-RORγt途徑抑制TH17細胞的分化來實現［36］。

2.2.3 淋巴細胞的節律性轉移 血液中T 細胞和B細胞表現出強烈的晝夜節律振蕩。在小鼠體內穩態條件下，淋巴結內的淋巴細胞也呈現晝夜節律振蕩，而且淋巴細胞數量峰值出現在小鼠活動階段［37］。在夜間CC 趨化因子受體 7（CC chemokine receptor 7，CCR7）和 CC 趨化因子配體 21（CC chemokine receptor 21，CCL21）表達水平達到最高，CD4+T 細胞、CD8+T 細胞和B 細胞在淋巴節中大量募集；而在Bmal1表達受到抑制后，依賴于時間的T 淋巴細胞歸巢與分布則受到抑制［38］。淋巴細胞從淋巴結進入傳出淋巴管并最終排出的節律性依賴于鞘氨醇1-磷酸受體 1（sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1P1）的節律性表達。Nakai 等［39］的研究表明，晚上遷移到淋巴結的細胞停留的時間也比白天遷移的細胞要長。

2.3 鐘基因與腸道菌群互作控制腸道穩態 微生物是腸道功能的重要調節因子，其代謝產物影響宿主免疫系統的發育，鐘基因異常表達可能通過改變腸道微生物群導致IBD的發病。

腸上皮細胞通過Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）及共同信號受體MyD88 來感知微生物以調節關鍵基因的表達［40］。腸樹突狀細胞（dendritic cells，DC）-ILC3 通路由革蘭氏陰性菌外膜中存在的鞭毛素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活DC中的TLR-MyD88信號，并通過細胞因子IL-23將細菌信號從 DC 傳遞到 ILC3，ILC3 通過產生 IL-22 向上皮細胞發出信號［41］，激活的 IL-22R 導致 STAT3 的磷酸化而與Rev-erbα啟動子結合并抑制其轉錄。

腸道微生物通過NFIL3 調節身體內的代謝［42］。腸道微生物能夠通過組蛋白脫乙酰酶3 來調節宿主代謝的晝夜節律，并且脂質轉運蛋白基因CD36的節律性轉錄也同樣依賴于腸道微生物［43］。

2.4 褪黑素減輕腸道炎癥 褪黑素作為一種激素分子產物從松果體釋放到循環系統中調節免疫系統和晝夜節律，其發揮作用主要存在兩種方式：依賴和不依賴于褪黑素受體［44］。研究顯示褪黑素也可由松果體以外組織和細胞誘導產生，包括腸黏膜、自然殺傷細胞、腸嗜鉻細胞和內皮細胞［45］。此外，線粒體可能是所有真核細胞褪黑素合成的主要部位［46］。

由小鼠睡眠剝奪引起的腸黏膜損傷及腸道微生物群失調與褪黑素受到抑制密切相關［47］。褪黑素可被用作抗氧化劑，通過抑制氧化應激和NF-κB 途徑的激活來逆轉因睡眠剝奪誘導的小腸黏膜損傷［48］。睡眠剝奪的小鼠腸道中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累導致小鼠的死亡率上升，在使用褪黑素進行治療后，小鼠腸道ROS含量降低，存活率顯著升高［49］。持續的環加氧酶（cyclooxygenase-2，COX-2）過表達參與了炎癥相關結直腸癌的發生［50］。在IL-1β 刺激的人腸上皮細胞炎癥反應中，褪黑素能抑制COX-2的表達，但褪黑素對腸上皮細胞炎癥反應的抑制作用只有在褪黑素的濃度與治療睡眠障礙膳食中褪黑素濃度相近時才會發生，生理條件下納摩爾級別濃度的褪黑素不具備這樣的效果［51］。此外，褪黑激素可以通過減少巨噬細胞中炎癥小體多蛋白復合物的形成減輕炎癥小體相關的血管疾病［52］。

3 總結

雖然鐘基因的節律性表達能夠在一定程度上通過調控CD4+T 細胞的發育及遷移、固有免疫細胞釋放炎性因子以及與腸道菌群等的相互作用來改變炎癥免疫微環境，干預炎癥疾病的發生發展，但是仍然還有許多值得深入研究的問題：鐘基因介導免疫系統干預腸道炎癥的具體機制是什么？不同的鐘基因在炎癥中是如何發揮作用的？在不改變光照周期的條件下，不同光譜是否能通過鐘基因抑制IBD 的發展？能否針對鐘基因設計相應的治療方案？隨著對鐘基因和IBD 更加深入的研究，將會提出更為行之有效的治療方案。