珠蛋白的氧化還原酶活性與腫瘤的關系*

馬文倩， 楊心治， 莫 靚， 游 詠△

（1南華大學衡陽醫學院轉化醫學研究室/蛋白質結構與功能實驗室，湖南衡陽421001；2南華大學附屬第一醫院胸外科，湖南衡陽421001）

珠蛋白是一類結構保守的血紅素蛋白家族，大部分生命中均有表達［1］。它們具有緊湊的螺旋構象和附著血紅素的能力，允許氣態雙原子分子可逆結合，包括氧（oxygen，O2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化碳（carbonic oxide，CO）等［1］，在機體中主要承擔氧的儲存和運輸功能。已知的珠蛋白主要有紅細胞特異性血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、肌肉中的肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、神經元和神經內分泌組織中的腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb），以及各種器官中普遍存在的胞紅蛋白（cytoglobin，Cygb）。4 種珠蛋白具有相似的結構，因此也具有相近的生物學活性，其中氧化還原酶活性是珠蛋白生物學活性研究中的重要內容。近期研究發現Cygb 的氧化還原酶活性在腫瘤的發展與治療中具有重要作用，而Ngb 可通過其氧化還原酶活性清除自由基從而預防神經退行性疾病。Hb/Mb 可通過其氧化還原酶活性降低NO的合成，從而調節NO 對血管的擴張作用，降低腫瘤組織的血流量，限制腫瘤細胞的營養來源達到限制腫瘤細胞生長的作用［2］。然而，調控這些珠蛋白氧化還原功能的機制尚不清楚，珠蛋白的潛在功能仍有待進一步深入研究［3］。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是有氧代謝的產物，包括超氧陰離子（superoxide anion，過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）和羥自由基（hydroxyl radical，·OH）；活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）是 NO 與包括 ROS 在內的化合物相互作用衍生出的一系列具有高度氧化活性的自由基和硝基類化合物，包括超氧亞硝酸根離子（peroxynitrite ion，ONOO-）及其質子形式過氧亞硝酸（peroxynitrous acid，HOONO）［4］，還有三氧化二氮（dinitrogen trioxide，N2O3）和二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2）。ROS 和RNS 的水平確立了細胞內的氧化還原狀態。ROS/RNS 在機體內可通過其含量的變化而調節、誘導腫瘤細胞增殖或凋亡相關信號分子表達，對腫瘤細胞的生長產生調節作用。研究發現珠蛋白可通過氧化還原酶活性調節 ROS/RNS 的濃度［3］，在腫瘤細胞中，珠蛋白是否也可通過這一活性影響細胞的增殖與凋亡可能為腫瘤的防治提出新的思路。本文將從珠蛋白的結構及其由結構決定的氧化還原酶生物學活性繼而清除ROS/RNS的功能和與腫瘤的關系進行探討。

1 4種珠蛋白結構的異同

生理條件下，珠蛋白的多肽鏈會盤繞折疊成球形，將血紅素分子包裹在球體內部，而輔基血紅素是卟啉環與Fe2+的絡合物。珠蛋白之間結構的差異主要表現在血紅素中心鐵的配位狀態、血紅素結合腔的微環境、血紅素與蛋白肽鏈之間作用的方式等。（1）Hb 由2 個α 亞基和2 個 β 亞基組成，而每個亞基都是由1 條多肽鏈和4 個含Fe2+的血紅素分子構成。血紅素是4個吡咯分子生成一個卟啉環，再結合1個Fe2+組成的一個小分子。卟啉環中心是吡咯的4 個氮原子與 1 個 Fe2+配位結合。（2）Mb 的主鏈與 Hb 的α鏈和β鏈折疊形成的三維結構非常相似，是由一條盤曲的肽鏈和一個血紅素輔基組成的具有三級結構的球狀蛋白質單體結構，與氧分離的狀態下包含5個配位鍵，易與氧氣結合。（3）Ngb 是一種具有典型螺旋折疊的珠蛋白，它與Hb 和Mb 的區別在于血紅素鐵配位的幾何構型不同：Ngb是一種六配位血紅蛋白，沒有外源配體的情況下，遠端組氨酸直接與鐵配位，使鐵和脫氧亞鐵血紅素鐵呈低自旋六軸［3］。（4）Cygb 的血紅素結構在性質上與Ngb 相似，在沒有外源配體的情況下也以六配位與鐵連接。

氧結合蛋白Hb 和Mb 在沒有外源配體的情況下是高自旋五配位的，遠端組氨酸不能與鐵形成離子鍵，而是形成氫鍵來穩定氧結合，如圖1 所示。珠蛋白通過與鐵結合或形成氫鍵發生電子的轉移變化，從而具有氧化還原酶的活性。

Figure 1.Heme structure diagram of Hb/Mb（A）and Ngb/Cygb（B）.圖1 Hb/Mb及Ngb/Cygb的血紅素結構圖

2 珠蛋白的結構決定清除ROS/RNS 的氧化還原酶活性

珠蛋白的活性中心血紅素/鐵，不僅有氧化酶活性，也有促進脂質過氧化的作用。病理情況下機體細胞內產生大量的ROS/RNS，羥自由基增多，珠蛋白釋放出血紅素和游離的鐵離子，與H2O2發生反應。此反應是Fe2+或（和）Fe3+與H2O2反應生成超價血紅素鐵：

（其中P 表示蛋白質，P·+表示蛋白質陽離子自由基）

以上反應主要在病理條件下發生，當自由基遷移到整個蛋白質或非預期的底物上，鐵基也可引發底物如脂質的氧化［3］。Fe4+可通過自身還原或氧化其他底物與Fe2+反應生成Fe3+。H2O2持續穩定地與P-Fe2+/P-Fe3+反應使珠蛋白失去攜氧能力，與此同時Fe4+通過Fe2+發生Fe4+與Fe3+的氧化-還原反應循環。細胞內存在的氧化自由基防御系統可以很快將Fe3+還原成Fe2+。

血紅素和蛋白質之間的共價鍵是由血紅素在酸性條件下通過鐵-鐵氧化還原循環形成［8-10］。作為Mb/Hb 氧化還原循環的一種穩定而特異的產物，血紅素和蛋白質之間的共價鍵有可能在體內發揮其先前氧化還原化學標志物的作用。發生橫紋肌溶解（肌肉損傷）后，動物模型的腎臟和人類患者的尿液中，均可檢測到血紅素-蛋白質交聯的Mb；蛛網膜下腔出血后，在腦脊液中也能檢測到Hb 的這種共價修飾，這些都是珠蛋白參與氧化還原反應的直接證據［3］。

3 ROS/RNS在腫瘤中的作用及其機制

氧化應激是由于氧化劑過量或抗氧化能力不足造成的氧化與抗氧化作用的失衡，腫瘤細胞內的氧化應激主要由大量 ROS 積聚產生造成的［4］。ROS 可以通過調節細胞內的信號分子進而調控包括增殖、分化、凋亡和遷移等各種生理過程［11］。ROS 可促進腫瘤細胞的增殖：（1）抑癌蛋白PTEN 的催化活性受到ROS的調節，其磷酸酶活性會被氧化應激抑制［12］。磷脂酰三磷酸肌醇（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路的第二信使，細胞內ROS升高PTEN失活導致細胞內PIP3水平升高，PIP3聚集在質膜上，并激活下游的PIP3靶標，包括蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）［13］。此外，活化的PI3K/AKT 信號會導致與細胞生存相關基因的表達增加如抗凋亡因子Bcl-2［13-14］。抗氧化處理抑制了細胞內磷酸化的PTEN 失活和隨之而來的AKT 激活。有研究表明，在Brca1缺陷型乳腺癌中，PTEN 的過量表達會抑制PI3K/AKT 的信號通路，降低腫瘤細胞對ROS 耐受的閾值，從而到達治療的作用［17］。線粒體中PTEN 的增加可進一步促進細胞內ROS 的產生。實驗證明PTEN的半胱氨酸殘基會被H2O2氧化失活，而PI3K/AKT 信號通路會被失活的PTEN 激活，從而有利于腫瘤細胞的存活和生長［13，15-16］。（2）還有實驗證明中低水平的ROS 可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號 調 節 激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的磷酸化，促進細胞周期蛋白cyclin D1 表達，從而誘導腫瘤細胞的表達［17］。氧化應激水平的增加導致蛋白質、脂質等大分子損傷，參與動脈粥樣硬化、糖尿病和腫瘤等疾病的發生發展［18］。另一方面ROS抑制腫瘤細胞的增殖與存活：（1）ROS可通過激活細胞凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路從而誘導細胞的衰老和死亡。H2O2可氧化硫氧還蛋白1（thioredoxin 1，TRX1）半胱氨酸殘基，導致與TRX1 結合的ASK1 的活化，活化的ASK1 又可以依次激活JNK 和p38 MAPK 途徑，抑制抗凋亡因子，從而促使細胞凋亡［19］。有實驗證明，在小鼠B 淋巴瘤細胞中，膜免疫球蛋白誘導H2O2的產生并激活ASK1/JNK途徑，導致細胞凋亡［20］。（2）ROS 還可通過抑制核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號從而影響核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路傳導，抑制腫瘤細胞的增殖發展［21］。已有研究表明，抑癌基因p53可促進ROS 的產生，并參與誘導細胞凋亡。PI3K/AKT/PTEN 通路是細胞衰老和凋亡的關鍵決定因素，細胞內ROS 的產生介導了PI3K/AKT/PTEN通路的發生［13］。

NO 及其衍生物RNS 對腫瘤細胞的作用也表現出雙重作用。一方面NO 可促進腫瘤細胞增殖和遷移：（1）NO 可誘導AKT 的磷酸化，在小鼠纖維肉瘤模型中，NO 通過AKT在869位半胱氨酸的硫醇氧化還原機制抑制細胞凋亡信號調節激酶1 的活性，啟動細胞凋亡保護。（2）在腫瘤細胞中缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）可通過增加遺傳不穩定性，從而改變細胞代謝和下調促凋亡蛋白提高腫瘤細胞的耐藥性。NO 濃度在100～400 nmol/L時，通過穩定HIF-1α 的結構，導致PI3K 活化從而促進癌細胞的存活和增殖［22］。（3）NO 濃度低于 400 nmol/L 可導致p53基因的突變，致使p53 失去對腫瘤細胞的抑制作用從而促進腫瘤細胞的增殖生長［23］。（4）NO 通過介導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）而促進腫瘤血管生成，從而促進腫瘤細胞的遷移［24-25］。另一方面NO 可抑制腫瘤細胞的增殖和存活：（1）高濃度的NO 可以穩定p53基因，導致細胞周期停滯和細胞生長抑制，抑制腫瘤細胞的增殖［25］。（2）NO 的濃度接近或超過 1 μmol/L 時，可通過蛋白質亞硝化、硝化和烷基化導致細胞凋亡［25］。N2O3是一種強亞硝化劑，可以使DNA堿基脫氨基，導致DNA 突變。N2O3也可通過烷基化與仲胺反應形成致癌的N-亞硝胺，破壞DNA。強氧化劑 ONOO-可引發脂質過氧化和裂解 DNA［25］。（3）NO 可以通過活化巨噬細胞殺傷腫瘤細胞［26］。見圖2。

Figure 2.The mechanism of ROS/NO in tumor cells.圖2 ROS/NO在腫瘤細胞中的作用機制

不同水平的ROS/RNS 對腫瘤細胞表現出不同的影響，ROS/RNS 在腫瘤細胞中的作用機制也尚待完善，當前在高水平ROS/RNS 對腫瘤細胞的作用及由此產生的與氧化應激相關的癌癥治療方面需要更多的研究，以便于更好地理解氧化應激相關的癌癥機制，并對于提高選擇性殺傷腫瘤細胞有極大的幫助。

4 珠蛋白在細胞中的表達

不同的應激條件如缺氧、氧化應激、葡萄糖剝奪以及脂多糖都會增加珠蛋白的表達，這表明珠蛋白作為應激反應傳感器可以將應激狀態轉移到信號轉導途徑［27］。這些發現表明珠蛋白有兩種不同但是相互關聯的功能：當細胞內ROS 濃度過高時珠蛋白對細胞有保護作用，同時珠蛋白還會參與對內外氧化應激的激活反應。此外，珠蛋白的表達受到內源性因素的促進，包括激素和生長因子。在不同的激素（如血管內皮生長因子和促紅細胞生成素）中［28］，17-雌二醇（17β-estradiol，E2）通過雌激素受體 Erβ 和ERβ 誘導高水平的珠蛋白表達，主要參與E2激活的細胞的抗凋亡途徑。其中，Ngb在線粒體中的定位要求很高，因為它具有對抗氧化應激的抗凋亡功能。在H2O2誘導的應激條件下，只有E2 誘導的線粒體重新分配的Ngb 與細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的胞漿釋放相互作用并損害Cyt-C 的釋放，從而阻止隨后的凋亡途徑的激活。多種協同的細胞機制支持E2誘導的珠蛋白表達。生理濃度的E2在ERα存在的情況下，迅速激活PI3K/AKT 途徑，進而阻止蛋白酶體和溶酶體珠蛋白的降解，并通過核轉錄因子CREBP的磷酸化增強珠蛋白基因的轉錄［29-30］。Ngb 上調是E2/ERα 復合物通過在線粒體水平阻止凋亡級聯反應來保護乳腺癌細胞免受氧化應激的關鍵機制之一［29-30］。在肝癌細胞HepG2 中也報道了類似的E2誘導的抗凋亡功能［29］。Fiocchetti 等［31］的實驗證明了氧化應激主要通過像E2類似的誘導蛋白抑制溶酶體蛋白降解和提高蛋白轉化率來增加Ngb 水平。在乳腺癌細胞中，氧化應激瞬時激活了PI3K/AKT 信號級聯反應，最終導致Ngb 上調，并將其主要定位在細胞質，在那里它可以作為直接的ROS清除劑，是ROS水平增加的第一屏障［30］。綜上所述珠蛋白可以直接影響腫瘤細胞的凋亡控制腫瘤的進程，或者通過其氧化還原酶活性清除或抑制ROS/RNS的表達間接影響腫瘤細胞。以上發現給珠蛋白在腫瘤防治方面發揮作用提供了理論基礎，目前還需要大量的實驗數據證明這一理論的可實施性，為珠蛋白應用到臨床中防控腫瘤奠定基礎。

5 珠蛋白對腫瘤的預防和治療

Hb 是運輸和儲存O2的主要載體，其他三類蛋白質也作為氧氣的載體，在應激狀態下釋放氧氣，補充細胞所需要的氧氣。生理條件下攜氧珠蛋白濃度直接影響人體血氧含量，以及在腫瘤細胞中的供氧。除此之外，Meyer 等［2］的研究發現 Hb 通過調節 NO 的濃度，減輕NO 對血管的擴張，降低乳腺癌中腫瘤組織的血流量，從而限制腫瘤細胞生長所需的營養來源。曲俊杰等［32］的研究表明Hb 被包裹在脂質體中，將O2輸送到腫瘤，促進了腫瘤部位微環境中缺氧的逆轉。HIF-1α和血管內皮生長因子的高表達可促進腫瘤的增殖和血管生成［33-34］，下調它們的表達從而抑制腫瘤的生長。

Mb 可通過清除或產生NO 分子來維持肌肉中NO 動態平衡［35］，參與調節血管舒張反應，保護呼吸鏈不受抑制［36］。Mb 的功能還包括合成過氧化物［37］、清除反應性 O2物種［38］和脂肪酸結合［39］。Mb 在各種腫瘤中都有表達，包括髓母細胞瘤［40］、胸腺脂肪瘤［41］、急性白血病［42］和促結締組織增生性小圓細胞腫瘤［43］以及肺部腫瘤等［44］。Kristiansen 等［45］的實驗發現Mb 在部分乳腺癌病例中大量表達。Mb 的表達與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的存在有很強的相關性，這解釋了與缺乏Mb 的腫瘤相比，Mb 陽性的腫瘤通常預后更好［45］。有研究發現Mb 前列腺癌中的表達校高，它受到缺氧的調節，與在乳腺癌中表達一樣，表現出顯著的轉錄復雜性［46-47］。有研究表明在上皮性腫瘤中脫氧Mb 可提高細胞NO 水平，促進p53 磷酸化。還會導致ROS 水平增加，通過ROS 影響p53 的穩定進而影響腫瘤細胞的狀態［48］。以上研究表明如果可以控制Mb的表達，那么就可以通過調節Mb從而調節腫瘤細胞的狀態。

Ngb 可通過改變ROS/RNS 的三維結構，影響蛋白質與包括氧在內的內源氣態配體的親和力來感知細胞內的氧化還原狀態或信號級聯的激活/失活狀態，并合理地調節Ngb 與蛋白質的相互作用和細胞內的定位的功能特性［49］。在神經細胞衍生的細胞中，渡邊等研究證明了氧化應激使Ngb 可與質膜上的Flotillin1相互作用，有利于其抑制Gαi蛋白和隨后的氧化應激誘導的細胞凋亡，從而作為氧化應激感受器能夠影響細胞的反應［27］。在惡性腫瘤細胞中也發現了類似的氧化應激敏感活性，例如上文提到的實驗在肝癌細胞中，研究發現Ngb 作為O2/ROS 感受器，在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中發揮腫瘤抑制作用。Ngb 通過將O2/ROS 信號與致癌的Raf/MAPK/ERK 信號聯系起來起到控制HCC 發展的作用［17］。還有Oleksiewicz 等［50］的研究表明在原發性肺癌標本中，NgbmRNA 的上調與HIF-1α 表達的增加呈現正相關。并且有報道指出Ngb 過表達在肺癌的細胞中起到腫瘤抑制的作用，其中Ngb 充當O2/ROS 信號與細胞增殖之間的信號聯系［26，50］。由于Ngb 在神經和非神經性癌癥中都是E2 誘導蛋白，所以根據受體ERα 和ERβ 的平衡狀態E2 在癌癥中發揮的作用也是雙向的［51］。這些數據表明腦紅蛋白可能成為癌癥治療的新靶點。

Cygb 在低氧條件下表達增多，表明Cygb 潛在的氧結合/傳感、清除 ROS/RNS 的還原酶功能［3］。啟動子甲基化下調Cygb 在口腔癌（100 例）、頭頸部鱗狀細胞癌（101 例）和非小細胞肺癌（127 例）中的表達，觀察到Cygb作為腫瘤抑制基因發揮作用［52］。Cygb缺陷小鼠已被發現會促進癌癥的發生，當暴露于致癌物質如二乙基亞硝胺時，還會促進肺和肝臟的癌變［53］。Xu等［9］通過對臨床上的膠質瘤患者研究證明Cygb 可以作為預后的獨立預測因子，它的缺失可能導致膠質瘤的腫瘤復發和較差的預后。在鱗狀細胞癌中，Cygb 的 mRNA 表達與 HIF-1α 相關，表明 Cygb的mRNA 表達受缺氧的調節，而Cygb 的mRNA 表達增加了腫瘤的侵襲性［54］。Cygb基因對角質形成細胞的增殖也有保護作用，在常氧條件下，防止外源性過氧化氫氧化損傷細胞［55］。這類研究表明，p63轉錄因子蛋白ΔNp63靶向調節Cygb基因，導致Cygb 表達上調，從而抑制氧化應激誘導的角質形成細胞的凋亡。這種機制也存在于肺和乳腺癌細胞系，說明Cygb 介導的清除反應性氧在上皮性腫瘤和肺癌中也有作用。此外，在人類肺癌數據集中，CygbNp63 和ΔNp63 基因的相互作用顯著降低了患者的存活率［55］。因此在 Cygb 與防癌研究中可以看出，Cygb 可以抑制腫瘤的進程［56-57］。上述機制的總結見表1。

表1 珠蛋白與腫瘤的相關機制及參考文獻Table 1.The mechanism and references of globin and tumor

2012 年在人類身上又發現了第5 種珠蛋白——雄球蛋白（androglobin，Adgb），這進一步擴大了人們對珠蛋白生物學活性和功能的興趣。Adgb 具有1667個氨基酸序列，包括鈣蛋白酶樣域、血紅蛋白結構域和 IQ 鈣調蛋白結合基序［58］。Adgb作為癌基因促進細胞增殖作用的發現在癌癥研究中具有重要意義［59］，然而，人們對這種多結構域蛋白知之甚少，還需要大量的研究去探索發現它的潛在作用。

6 總結與展望

ROS 和抗氧化劑激活系統之間的平衡建立了細胞內氧化還原的水平，而這種平衡的精細調節是細胞正常功能和生存必需的［60］。在細胞水平上，清除ROS 在很大程度上依賴于酶的激活，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還蛋白和硫氧還蛋白，這些酶總體上構成了細胞的抗氧化防御機制［60］。當細胞內的抗氧化能力不足以清除ROS 時，細胞保護機制被激活，珠蛋白清除部分ROS/RNS 從而削弱由于氧化損傷造成的細胞死亡。

珠蛋白的各種功能，包括氧氣傳感、運輸和儲存；以及基于血紅素的氧化還原酶活性的ROS/RNS的合成和清除；及其在腫瘤發生發展過程中的作用表明珠蛋白很可能成為腫瘤治療的新靶點。胞內珠蛋白直接參與腫瘤細胞建立的抗氧化系統，對抗ROS 的增加，細胞內不同的珠蛋白可能通過不同的機制協同作用，以提高腫瘤細胞的存活率，促進細胞對應激腫瘤微環境的適應。在這一點上，任何能夠改變珠蛋白水平、細胞內定位和反應性的刺激都可能增加腫瘤細胞對氧化應激誘導的細胞死亡的易感性。未來破譯這些珠蛋白的生物學活性、在疾病中的作用機制將有望在許多疾病的防治上發揮重要作用。