一種小鼠2型糖尿病合并動脈粥樣硬化模型的構建方法及評價*

楊金偉， 喻 嶸 ， 吳勇軍 ， 劉 秀， 鄧奕輝△

（湖南中醫藥大學 1中西醫結合學院，2研究生院，3中醫方證研究轉化醫學湖南省重點實驗室，4藥學院，湖南長沙410208）

糖尿病（diabetes mellitus）是由于胰島β 細胞損傷（胰島素分泌缺陷）及胰島素抵抗狀態（生物作用受損），出現以慢性血糖增高為特征的代謝紊亂綜合征［1］。據國際糖尿病聯盟于2019 年發布的最新全球糖尿病地圖（第9 版）的數據統計，全球成人糖尿病患者（20～79 歲）已增至4.63 億。我國糖尿病患者約1.164 億，以2 型糖尿病為主，而心腦血管并發癥是致死的主要原因［2-3］，病變累及心、腦大血管形成動脈粥樣硬化，嚴重者引起組織缺血壞死。目前糖尿病合并動脈粥樣硬化的病因及各種并發癥的發病機制尚未完全闡明，而理想動物模型的建立是實驗研究的基礎。

小鼠2 型糖尿病動脈粥樣硬化實驗模型制備方法主要有3 類：（1）基因雜交，將糖尿病模型小鼠與動脈粥樣硬化模型小鼠進行雜交，但因其操作方法較為復雜、繁殖小鼠存在基因修復情況、制備成功率不明確等因素限制了實驗使用［4］。（2）以動脈粥樣硬化小鼠（ApoE-/-小鼠）為基礎，配合鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）對小鼠胰腺損傷，模擬糖尿病過程。ApoE-/-小鼠可自發形成明顯的粥樣斑塊，在高脂及STZ 的聯合誘導下存在明顯的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗狀態，實驗過程中操作相對簡單可靠，現階段較多使用［5-6］。（3）以糖尿病模型小鼠為基礎制備動脈粥樣硬化模型，多采用喂養高脂飼料，可較好地模擬2 型糖尿病并發血管病變的病理過程，但研究對象的選擇及誘導干預方法的不同，使其動脈粥樣斑塊的發生率和程度不明確。本課題組對2 型糖尿病動脈粥樣硬化的研究中，以MKR 小鼠作為研究對象，聯合STZ 及N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine-methyl ester，L-NAME）干預誘導，成功建立了穩定的2 型糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模型，可為研究糖尿病大血管病變的發病機制及治療措施提供參考。

材料和方法

1 實驗動物

本實驗的MKR 小鼠為胰島素/胰島素樣生長因子雙重受體缺陷的轉基因糖尿病小鼠，從美國國立衛生研究院（NIH）的Dr.Derek LeRoith 和Dr.Jun-Li Liu 處引進，湖南中醫藥大學SPF 級動物實驗室自繁自用。FVB/N 及ApoE-/-小鼠由湖南中醫藥大學SPF實驗動物中心向北京維通利華實驗動物技術有限公司訂購，許可證號為SYXK（湘）2013-0005。

2 實驗飼料及試劑

普通飼料（編號U05615908，Co60輻照實驗鼠維持飼料）、膽固醇及膽酸鈉（江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司）。高脂乳劑配方：膽固醇50 g、豬油100 g、丙基硫氧嘧啶1 g、膽酸鈉10 g、吐溫80 100 mL和丙二醇100 mL，蒸餾水定容至500 mL。以上均經滅菌處理。STZ（Sigma）；丙基硫氧嘧啶片和LNAME（上海源葉生物科技有限公司）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（南京建成科技有限公司）；C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及IL-18 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；兔源基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）抗體和金屬蛋白酶組織抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）單克隆抗體（Abcam）。

3 實驗方法

3.1 動物分組飼養 8周齡MKR小鼠20只，隨機選取10 只作為MKR 空白（MKR blank）組，剩余MKR 小鼠與FVB/N、ApoE-/-小鼠給予溶于檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）中的STZ 40 mg·kg-1·d-1，連續5 d 進行腹腔注射造模，測得空腹血糖＞11.1 mmol/L，則表示糖尿病造模成功；糖尿病造模成功后，除MKR空白對照組予生理鹽水，其余MKR小鼠予L-NAME 0.2 mg·kg-1·d-1，同時聯合高脂乳劑10 mL·kg-·1d-1灌胃進行造模12 周，建立糖尿病動脈粥樣硬化模型。另取10 只FVB/N 小鼠作為正常（normal）組，以普通維持飼料飼養。飼養條件：溫度（22±2）℃及相對濕度（50±5）%，光/暗周期為12 h/12 h。自由飲水，每日更換飲水瓶，定期清理籠具與墊料，通風，光線良好。

3.2 觀察指標 取材前1 d，小鼠禁食不禁水8 h，小鼠尾靜脈采血應用電化學法血糖儀檢測空腹血糖；配制10%的水合氯醛4 mL/kg 腹腔注射麻醉，心臟采血后處死小鼠，收集血液，分離血清，用于血脂相關指標和胰島素。用組織剪剝離小鼠胰腺，剔除胰腺組織周邊脂肪，取出完整的胰腺組織。同時暴露心臟，自主動脈起始部開始分離向下至骼總動脈分叉處，向上分離左側頭臂干動脈和無名動脈，將心臟與血管一同取下，切取小鼠主動脈組織放入2 mL 4%多聚甲醛固定液常溫保存24 h 做HE、Masson 染色及免疫組化檢測。

3.3 血脂、胰島素及血清 CRP、TNF-α、IL-1β 和 IL-18水平的檢測 應用全自動生化分析儀檢測血脂相關指標（包括TC、TG、HDL-C、LDL-C）。ELISA 法測定小鼠血清 CRP、TNF-α、IL-1β 及 IL-18 的含量。稀釋和加樣后用封板膜進行封板溫育，配液洗滌進行加酶，通過顯色后以450nm 的波長依次測量每孔吸光度。化學發光法測定胰島素水平。胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=空腹血糖×血清胰島素水平/22.5。

3.4 小鼠胰腺及動脈HE 染色 石蠟包埋，切片厚度3～4 μm，60 ℃烤片1～2 h；脫蠟：切片置于二甲苯中10 min，2 次。依次在100%、95%、85%和75%乙醇，每級放置5 min。蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染5～10 min，PBS 返藍；伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精脫水；中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

3.5 小鼠動脈Masson 染色 石蠟包埋切片（3 μm）；切片脫蠟至水，核染液染色3～5 min；沖洗染色液，PBS浸泡切片5～10 min，胞核返藍；滴加漿染液染色2 min；分色液分色30 s；滴加復染液染色6～8 min，無水乙醇沖洗干凈；吹干、透明、封片，顯微鏡觀察。

3.6 免疫組化法測定MMP-9 和TIMP-1 的表達水平 脫蠟前60 ℃恒溫箱烘烤60 min；常規二甲苯浸泡兩次脫蠟，依次用100%、95%、85%和70%濃度乙醇梯度水化5min；PBS 浸泡5 min，清洗 3 次；抗原修復后再次PBS浸泡5 min，清洗3次。樣本處理后，免疫組化檢測MMP-9和TIMP-1陽性表達率，加HRP滅活液覆蓋樣本，冰上放置，PBS 浸泡2 min，洗滌3 次；經水化、封閉，通過抗體稀釋液稀釋I 抗（1：100），加入 100 μL，每片 1 μg 抗體 I 抗孵育、II 抗孵育。制備DAB 顯色液，運用顯微鏡下觀察染色的程度，染好后立刻終止反應；將切片放入蘇木素染液中，5 min 后用蒸餾水清洗干凈，封片后于顯微鏡下拍照并計算MMP-9 和 TIMP-1 陽性細胞數。MMP-9 和 TIMP-1 陽性表達形式為胞核或胞漿呈棕黃色顆粒。

4 統計學處理

實驗數據均運用SPSS 19.0統計軟件處理。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較若滿足正態性者，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；不滿足正態性資料用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠血糖、血脂和胰島素水平及胰島素抵抗指數的變化

造模誘導過程中正常組小鼠空腹血糖波動不明顯；MKR 小鼠在誘導干預為動脈粥樣硬化模型前血糖較其他組增高；通過腹腔注射STZ 及高脂乳劑的灌胃，FVB/N、ApoE-/-及MKR 小鼠血糖較正常組均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），ApoE-/-及MKR模型組升高尤為明顯，而這2 組間無顯著差異（P＞0.05）；整個造模周期中，MKR 小鼠體現出較為穩定的血糖高值，見圖1。

Figure 1.Comparison of fasting blood glucose in each group.Mean±SD. n=10.＃P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖1 各組小鼠空腹血糖的變化

與正常組相比，ApoE-/-及 MKR 模型組 TG、TC 和LDL-C 水平顯著增高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05），說明MKR 小鼠經造模后存在血脂代謝異常；FVB/N 對照組及 MKR 空白組小鼠 TG、TC 和 LDL-C水平較正常組高（P＜0.05），但仍不及MKR 模型組血脂的水平（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The levels of serum lipids in each group.Mean±SD.n=10.＃P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖2 各組小鼠血脂水平的變化

造模12周后，與正常組相比，其余各組小鼠血清胰島素水平及胰島素抵抗指數均顯著升高（P＜0.05）；與FVB/N對照組比較，ApoE-/-及MKR模型組小鼠血清胰島素水平及胰島素抵抗指數進一步升高（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.Comparison of fasting serum insulin level and HOMA-IR in each group.Mean±SD. n=10.＃P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖3 各組小鼠空腹血清胰島素水平及胰島素抵抗指數的變化

2 各組小鼠炎癥相關因子變化情況

高脂乳劑及L-NAME 持續誘導后，FVB/N 對照組、ApoE-/-模型組及MKR模型組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β 及IL-18 水平較正常組顯著升高（P＜0.05），其中以ApoE-/-及MKR 模型組更明顯，而這2 組間的差異無統計學顯著性（P＞0.05）；與 MKR 空白組比較，MKR 模型組血清中炎癥因子水平顯著升高（P＜0.05），說明L-NAME 的持續干預可誘導炎癥因子釋放過程，見圖4。

Figure 4.Comparison of CRP，TNF-α，IL-1β and IL-18 levels in each group.Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖4 各組小鼠CRP、TNF-α、IL-1β及IL-18水平的變化

3 各組小鼠胰腺、主動脈染色特征分析

小鼠胰腺HE 染色病理切片顯示，正常組胰島清晰可見，胰島與周圍外分泌腺邊界清晰，胰島內可見豐富清晰的毛細血管；MKR 空白組胰島細胞大小不等、分布不均，胰腺小葉結構紊亂；FVB/N 對照組可見部分胰島細胞空泡變性，胰島組織有輕微炎癥因子浸潤；ApoE-/-及MKR 模型組胰腺的外分泌部侵入胰島，胰島萎縮，大量炎癥因子浸潤。

小鼠動脈HE 染色病理切片顯示，正常組主動脈內膜完整光滑，細胞排列整齊，未見炎癥細胞聚集及斑塊形成；MKR空白組主動脈內膜增厚，有斑塊突出管腔，纖維組織排列紊亂；FVB/N 對照組主動脈有散在粥樣斑塊，中膜增厚伴部分平滑肌細胞增生，排列尚可，未見鈣鹽沉積及明顯泡沫細胞堆積；ApoE-/-及MKR 模型組小鼠主動脈均有明顯動脈斑塊形成，管腔變窄，內膜明顯增生，內含泡沫細胞及膽固醇結晶。應用圖像分析儀分析斑塊面積及Masson染色后含膠原斑塊的面積，結果顯示，與正常組比較，ApoE-/-模型組及MKR 模型組斑塊面積與動脈壁橫切面積的比值和含膠原斑塊面積與斑塊面積的比值均顯著升高（P＜0.05）。見圖5。

Figure 5.The pathological changes of pancreatic and arterial tissues observed by HE and Masson staining（×400），and comparison of ratios of plaque area/lumen cross area and area containing collagen/plaque area in each group.Mean±SD. n=5.#P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖5 各組小鼠胰腺和動脈組織的HE和Masson染色及主動脈粥樣硬化斑塊面積和含膠原斑塊面積的變化

4 各組小鼠主動脈組織MMP-9 及TIMP-1 蛋白表達水平的變化

與正常組相比，MKR 空白組、FVB/N 對照組、ApoE-/-模型組及MKR模型組MMP-9陽性表達率均顯著升高，TIMP-1 陽性表達率均顯著降低（P＜0.05），MMP-9/TIMP-1 比值顯著升高；與MKR 模型組比較，MKR 空白組和FVB/N 對照組MMP-9 表達水平降低，TIMP-1 表達水平升高（P＜0.05），而ApoE-/-模型組與MKR模型組之間無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

Figure 6.The protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in the arteries detected by immunohistochemical staining.Mean±SD. n=5.#P＜0.05 vs normal group；*P＜0.05 vs MKR model group.圖6 各組小鼠主動脈組織MMP-9及TIMP-1免疫組織化學染色

討 論

糖尿病動脈粥樣硬化是一個復雜的多細胞、多因素參與的慢性炎癥性病理過程［7］。基本病理學特征是粥樣斑塊的形成。動脈內皮細胞損傷，出現脂質蓄積于內膜處，平滑肌細胞、泡沫細胞和膠原纖維積聚增生，隨著病程進展伴有壞死、鈣化的病變。糖尿病動脈粥樣硬化的進程是多種致病因素交互的結果［8］。借助基因敲除手段輔以STZ誘導及高脂飼料，ApoE-/-小鼠在實驗研究中可較好建立糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模型。但其本身存在較為明顯的血脂代謝障礙及自發形成粥樣斑塊的特性，研究中難以區分加速的動脈粥樣硬化是糖尿病的作用還是血脂代謝障礙的作用。

2 型糖尿病有胰島素抵抗引起的高血糖和高胰島素血癥的病理特征［9］。MKR 小鼠是美國國立衛生研究院Dr.Derek LeRoith 等于2001 年建立的轉基因非肥胖型2 型糖尿病動物模型小鼠［10］。該小鼠具有骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）缺陷而形成IGF-1和胰島素受體（insulin receptor，IR）突變混合受體的特性，其 IGF-1 和 IR 功能均受損。MKR 小鼠在5周齡有明顯的血糖升高、胰島素抵抗、糖耐量異常及血脂代謝紊亂（LDL-C 和 TG 水平升高，HDL-C 水平降低）［11-12］，表現出高血糖、高血脂、高胰島素血癥及周圍組織胰島素抵抗等特點并能穩定遺傳，是良好的2型糖尿病及并發癥研究的動物模型［13］。本研究中持續的高脂乳劑灌胃不僅可促使脂質代謝失衡也可更好維持胰島素抵抗狀態，STZ小劑量注射破壞胰島功能，進一步確定模型的構建且體現胰島素分泌不足的病理特點。L-NAME 的干預可加重血管的炎癥損傷及粥樣斑塊的形成［14］。

本實驗MKR模型組HE染色胰腺小葉結構破壞，大量腺泡萎縮形成空泡甚至破裂，炎癥因子浸潤明顯；主動脈內膜增生，出現部分缺失；可見巨噬細胞，內膜含泡沫細胞；中膜增厚伴平滑肌細胞增生，排列不整齊。模型構建符合糖尿病動脈粥樣硬化臨床發病特點，在病理形態上出現了典型的胰腺損傷和粥樣斑塊形成的相關表現。糖脂代謝失衡是糖尿病動脈粥樣硬化過程中的重要危險因素，機體持續高血糖及胰島素抵抗狀態的存在可誘導機體代謝異常、炎癥反應及氧化應激損傷的持續狀態，是疾病發展的始動因素［15］。而循環血中的膽固醇尤其是LDL-C 在氧化修飾后形成的ox-LDL，是啟動炎癥性病理過程重要因素。實驗結果顯示造模誘導干預下MKR 小鼠FBG、TG、TC及LDL-C水平明顯增高，且較ApoE-/-模型組有更穩定的血糖高值、高胰島素血癥及胰島素抵抗狀態，較好地模擬代謝紊亂狀態下粥樣斑塊形成過程。同時粥樣斑塊的形成是一個慢性炎癥反應的過程，炎癥可引起斑塊不穩定。CRP、TNF-α、IL-1β及IL-18等炎癥因子在動脈粥樣硬化斑塊處沉積且沉積的范圍與斑塊的不穩定性呈正相關已被多數研究證實：CRP作為機體炎癥及感染敏感指標，可調節血管壁炎癥反應，同時參與補體激活及巨噬細胞泡沫化［16］；TNF-α由單核巨噬細胞釋放，介導粥樣斑塊形成中的免疫炎癥反應，在趨化因子的刺激下促進血小板黏附及脂質蓄積［17］；IL-1β 可通過上調免疫效應（活化Th1、Th17和體液免疫），促進炎癥局部釋放及血栓形成；IL-18水平增高可刺激干擾素γ 釋放，活化中心粒細胞、巨噬細胞及黏附分子對血管內皮細胞產生損傷［18］。MKR 模型組小鼠血清出現明顯的炎癥因子含量增高，反映了模型炎癥釋放的病理特點。同時，斑塊纖維帽的厚薄程度和完整性是評估斑塊穩定性重要因素。膠原是纖維帽的重要組成成分，機體內MMPs一旦被激活，整個細胞外基質能夠被其分解，其中明膠酶MMP-9表達水平對預測易損性斑塊具有較高的敏感性和特異性。TIMPs 作為MMPs 的天然抑制劑，其作用是抑制MMPs的活化，延緩動脈粥樣硬化的形成和進展，MMPs 和TIMPs 表達的平衡直接影響斑塊穩定性。本研究的免疫組化結果顯示，MKR 模型組動脈管壁及斑塊內MMP-9 的陽性表達量明顯升高，同時TIMP-1的表達下調，引起MMP-9/TIMP-1的失衡狀態，細胞外基質降解，促進斑塊不穩定。

綜上所述，MKR 模型組小鼠具備高血糖狀態持續和糖尿病加速動脈粥樣硬化的病理過程，且上述作用對醫學干預不抗拒，可在2 型糖尿病動脈粥樣硬化的實驗研究中使用。