EphA2蛋白在胃癌組織中的表達及與預后的關系*

楊勝男，李卓群，徐海榮，王云帥，王皇建，寇 玉△

(1.揚州大學醫(yī)學院，江蘇揚州 225000；2.鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院胃腸外科，河南洛陽 471000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，2018年全球胃癌新發(fā)病例中胃癌位于惡性腫瘤發(fā)病率第5位、病死率第3位[1]。EphA2受體最初被稱為Eck(上皮細胞激酶)，由LINDBERG等1990年篩選人類上皮(HeLa)cDNA文庫得出，高表達于上皮來源的細胞系，在腸、肺、皮膚、腎臟中的表達較高[2]。EphA2受體與配體結合后產(chǎn)生的信號轉導能直接參與各種生理活動,包括胚胎發(fā)育,特別是神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng),以及細胞與細胞之間的連接、細胞的遷移等[3]。EphA2基因的過度表達常與不良預后相關。其參與了許多對惡性進展至關重要的過程，如遷移、侵襲、轉移、增殖、存活和血管生成[4-5]。在宮頸癌中，EphA2的表達與腫瘤分化程度、浸潤肌層深度、淋巴結轉移有關,且與宮頸癌患者分期預后相關，隨著宮頸病變病理分級升高，EphA2蛋白在相應組織中表達陽性率逐漸提高[6]。但是關系EphA2與胃癌之間的關系報道較少，本文通過檢測EphA2在胃癌組織中的表達，分析EphA2表達與胃癌患者臨床病理因素的關系及預后的影響。

1 材料與方法

1.1 資料來源

收集2014年1月至2016年7月鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院胃腸外科收治的胃癌手術治療且術后病理確診胃癌患者73例胃癌組織樣本，隨訪至2020年6月。納入標準：(1)術前未經(jīng)放化療治療；(2)行胃癌根治性切除術，并經(jīng)病理醫(yī)師確診；(3)有詳細完整的病例及隨訪資料。排除標準：(1)臨床病理資料不全者；(2)合并其他腫瘤疾病者；(3)術前經(jīng)過放化療者。

1.2 主要試劑

兔IgG免疫組織化學試劑盒SABC即用型1(SA1022)購自武漢博士德生物公司； DAB染色試劑盒(AR1022)購自武漢博士德生物公司；EphA2抗體(#6997)購自美國Cell Signaling Technology公司；蘇木精染色試劑(E808F A0004) 購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 免疫組織化學

石蠟切片于60 ℃烤片2 h，二甲苯和乙醇按梯度脫蠟復水，3%過氧化氫避光室溫10 min滅活內(nèi)源酶，PBS漂洗3次，0.1%TritonX-100室溫透膜15 min，PBS漂洗3次，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液微波煮沸熱修復3 min,2次，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉30 min，除去多余液體，滴加一抗(1∶1 000)，放置濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，滴加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)，室溫孵育1 h，PBS漂洗3次，DAB顯色約2 min，出現(xiàn)棕黃色蒸餾水終止顯色，用含乙醇的蘇木精染色約2 min，顯微鏡下觀察染色情況，脫水透明，中性樹脂封片。為了量化EphA2的免疫染色，將載玻片在相等的曝光量下進行數(shù)字成像，并通過數(shù)字化的Image J軟件評估免疫陽性細胞百分比。細胞染色強度分為：0為不顯色；1為淺黃色；2為棕黃色；3為深褐色。免疫染色結果由免疫陽性細胞百分比(0～100)乘以染色強度得分(0、1、2和3)得出0～300分。以患者生存狀態(tài)作為狀態(tài)變量繪制ROC曲線圖,根據(jù)曲線圖形,EphA2表達評分在27.49分時對應的約登指數(shù)最大,選取27.49分為最佳截點(圖1)，根據(jù)EphA2表達水平分為陰性組(<27.49分,n=33)和陽性組(≥27.49分,n=40)。

圖1 ROC曲線選取最佳截點

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用ROC曲線確定EphA2陽性陰性表達的截點。生存分析采用Kaplan-Meier分析和 Log-rank 檢驗，單因素分析采用Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 EphA2在胃癌組織中的表達

73例胃癌組織中，胃癌組織EphA2陽性率為54.8%，而癌旁組織中無陽性表達(P<0.05)，見表1。EphA2高表達于胃癌組織，染色較深；于癌旁組織低表達，染色較淺，見圖2。

表1 EphA2在胃癌組織和癌旁組織中的表達[n(%)]

圖2 EphA2在胃癌組織與癌旁組織的表達(SABC，×400)

2.2 EphA2表達與臨床病理特征之間的相關性

EphA2的表達與腫瘤最大徑相關(P=0.009)，與患者性別、年齡及浸潤深度、TNM分期、遠處轉移、分化程度、淋巴結轉移相關性不顯著(P>0.05)，見表2。

2.3 EphA2表達與胃癌術后患者3年、5年生存率的關系

生存分析顯示，EphA2蛋白表達陽性與陰性患者之間的生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。EphA2陽性組3年生存率為50.00%，5年生存率為0。EphA2陰性組3年生存率為69.69%，5年生存率為30.30%。EphA2陽性組3年生存率及5年生存率低于陰性組(P<0.05)。

圖3 EphA2陰性組與陽性組生存曲線

表2 EphA2與臨床病理特征的關系[n(%)]

續(xù)表2 EphA2與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 影響患者無病生存時間的危險因素分析

單因素分析示，腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及EphA2表達與胃癌患者無病生存時間相關(P<0.05)，見表3。多因素分析示，腫瘤最大徑、TNM分期及EphA2表達是影響胃癌患者預后無病生存時間的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表3 Kaplan-Meier單因素分析患者無病生存時間 及總生存時間影響因素

表4 COX回歸多因素分析患者無病生存時間影響因素

2.5 影響患者總生存時間的危險因素分析

單因素分析示，腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及EphA2表達與胃癌患者總生存時間相關(P<0.05)，見表3。多因素分析示：腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期及EphA2表達是影響胃癌患者術后總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 COX回歸多因素分析患者總生存時間影響因素

3 討 論

有研究報道，EphA2在腫瘤中不僅扮演著促癌因子的角色，還有作為抑癌因子的發(fā)現(xiàn)[7]。配體EphrinA1依賴的EphA2的激活主要發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長、增殖和遷移的作用。然而EphrinA1蛋白水平與腫瘤分期密切相關，晚期腫瘤患者中 EphrinA1蛋白表達較低[8-9]。過表達的EphA2在多種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，如黑色素瘤、乳腺癌[10]、結腸[11]、肺癌[12]等。EphA2是腫瘤轉移的關鍵驅動因子和不良預后的關鍵預測因子[13-14]。本研究中，過表達的EphA2與胃癌的進展及不良預后相關。在腎細胞癌中，EphA2腎癌組織中過表達且與腫瘤大小、核分級、腫瘤分期、患者預后有顯著相關性[15]。本研究中，EphA2在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，EphA2表達與腫瘤最大徑相關，且腫瘤最大徑大于或等于4 cm，EphA2蛋白陽性表達率越高。

前列腺癌中，高表達EphA2組生化復發(fā)率高于低表達EphA2組，多因素分析顯示，高表達EphA2是生化復發(fā)的獨立預后因素[16]。在喉鱗狀細胞癌中，癌組織中EphA2陽性表達率明顯高于癌旁組織。EphA2表達與喉癌組織學分級、T分期、臨床分期、淋巴結轉移、復發(fā)及預后相關，EphA2表達是影響喉癌預后的獨立因素，在喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和預后不良中可能起重要作用[17]。EphA2表達陽性與陰性患者之間的生存率差異有統(tǒng)計學意義，與上述討論一致。Cox多因素分析結果顯示，EphA2高表達是影響胃癌患者預后無病生存時間及總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)。

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合的復雜過程，其預后與多重因素相關[18]。研究報道，腫瘤最大徑[19]、TNM分期[20]、腫瘤分化程度[21]、淋巴結轉移[22]都是影響胃癌預后的重要因素。 本研究中,Cox回歸模型多因素分析還發(fā)現(xiàn)腫瘤最大徑、TNM分期、EphA2表達是患者影響患者無病生存時間的獨立危險因素。腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期及EphA2高表達是影響患者總生存時間的獨立危險因素。腫瘤最大徑越大、分化程度越差、TNM分期越差，患者預后越差。

綜上所述，EphA2在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且與患者病理特征及預后相關，可作為臨床醫(yī)生評估患者預后的參考指標之一。但本研究樣本量較少，下一步需擴大樣本量，進一步研究EphA2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義。