104個甘薯品種的cpSSR指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析

王崇 王連軍 楊新筍 雷劍 柴沙沙 張文英 焦春海 田小海

摘? 要：基于甘薯葉綠體基因組，利用cpSSR分子標記，對104份甘薯栽培品種和地方品種進行遺傳多樣性分析并構建指紋圖譜，為甘薯資源的保護鑒定和遺傳改良提供參考。使用了11對cpSSR引物，在104個甘薯材料中總共擴增得到58條條帶，多態性條帶為47條，單條引物平均擴增的條帶數為5.27，平均多態性百分率為81.03%。根據引物在甘薯材料中的擴增結果，構建104個甘薯品種的指紋圖譜。對104個甘薯品種的擴增結果進行聚類分析，每個品種間的遺傳距離為0.0386～5.2723，平均遺傳距離為0.2201，在遺傳系數為0.74時將104個甘薯品種分為5組。

關鍵詞：甘薯;cpSSR分子標記;遺傳多樣性;指紋圖譜

中圖分類號：S531????? 文獻標識碼：A

Construction of cpSSR Fingerprints and Genetic Diversity Analysis of 104 Sweetpotato Varieties

WANG Chong1， 2， WANG Lianjun1*， YANG Xinsun1， LEI Jian1， CHAI Shasha1， ZHANG Wenying2， JIAO Chunhai3**， TIAN Xiaohai2*

1. Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement? /? Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences / Hubei Sweetpotato Engineering and Technology Research Centre， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China; 3. Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China

Abstract： Based on the sweetpotato chloroplast genome， this study developed cpSSR molecular markers and analyzed the genetic diversity of 104 cultivars and landraces sweetpotato. A fingerprint map was constructed to provide references for the protection identification and genetic improvement of sweet potato resources. 11 pairs of cpSSR markers were used in this study. A total of 58 bands were amplified from 104 sweetpotato materials， with 47 polymorphic bands. The average number of bands amplified by a single primer was 5.27， and the average polymorphism percentage was 81.03%. Based on the amplification results of the primers in the sweet potato material， the fingerprints of 104 sweet potato varieties were constructed. Cluster analysis was performed on the amplification results of 104 sweetpotato varieties. The genetic distance between each variety was 0.0386 to 5.2723， and the average genetic distance was 0.2201. When the genetic coefficient was 0.74， the 104 sweet potato varieties were divided into 5 groups.

Keywords： sweetpotato; cpSSR marker; genetic diversity; fingerprinting

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.006

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam]是雙子葉植物，屬旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea Linn.），是重要的糧食、飼料、工業原料和新型能源作物，是世界第七大糧食作物，中國第四大糧食作物[1]。全球甘薯種植面積和產量分別為832.79萬hm2和1.064億t，中國甘薯種植面積為337.28萬hm2，產量0.85億t，分別占全球甘薯種植面積和產量的40.5%與67.0%，均居世界首位[2]。甘薯是同源六倍體植物，染色體數目多，遺傳信息復雜，給甘薯的遺傳改良和親本選配帶來了一定的困難[3]。

分子標記技術是作物育種的一種重要手段，Selaocoe等[4]使用RAPD標記對31份在南非種植的甘薯品種進行分析，為甘薯的營養改良和抗逆育種提供了參考;蘇文瑾等[5]利用SLAP-seq技術，以300份甘薯資源為材料，開發出795 794個SNP位點，為SNP在甘薯資源的鑒定、高遺傳圖譜的構建和重要性狀關聯分析奠定了基礎;Zhao等[6]通過AFLP標記和SSR分子標記，對‘徐薯18和‘徐781的F1分離群體202個株系構建雙親連鎖圖譜，得到父母本的90個連鎖群。分子標記技術還被應用于構建植物的指紋圖譜，通過構建植物DNA指紋圖譜可有效鑒定植物品種的真實性，在水稻、馬玲薯、棉花等作物中的品種保護上起到重要作用[7-9]。如胡文舜等[10]利用SSR標記技術構建了19個枇杷雜交品種的指紋圖譜，驗證了分子標記指紋圖譜在區分雜交品種上的可行性;聶立園等[11]基于SSR標記，采用篩選核心引物的方法，構建了132份甘薯種質的指紋圖譜，可對甘薯品種進行有效區分;王崇等[12]利用cpSSR標記，對16份甘薯品種進行遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構建，顯示品種間遺傳多樣性豐富，構建的甘薯指紋圖譜可用于品種鑒定。綜上所述，結合分子標記技術構建甘薯指紋圖譜，可為甘薯新品種保護和資源鑒定提供新的指導。

葉綠體微衛星（chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）標記是基于植物葉綠體基因組開發的一種分子標記，兼具普通SSR標記和葉綠體基因組的特點。具有引物多態性高、重復性好、分布廣、數量豐富等優點，又兼顧cpDNA序列保守、進化緩慢、結構簡單、單親遺傳等特點[13]，cpDNA中大多數編碼蛋白基因與光合作用和許多生化過程相關，如淀粉合成和氮代謝等，還可能參與植物的免疫反應[14-15];cpDNA中還包含許多保守區域，可為植物的系統分類和條形碼（DNA binding）提供參考[16]。cpSSR分子標記技術在居群保護、植物種群結構分析、親緣關系鑒定和系統發育的研究中被廣泛應用[17]。Lee等[18]使用8對多態性好的cpSSR引物，對來自中國、日本、美國、韓國等10個國家的558個甘薯品種進行遺傳多樣性分析，結果表明甘薯的母本遺傳多樣性低;Saxena等[19]開發出17對cpSSR引物對7份不同樹豆種質資源進行分析，結果表明cpSSR標記可有效鑒定樹豆栽培種和野生種;Yan等[20]開發cpSSR標記，表明該標記可用于水松的種群遺傳和地理結構分析。本研究采用cpSSR標記技術，對104個甘薯品種進行遺傳多樣性分析，并構建指紋圖譜，旨在為甘薯品種的鑒定區分和優質品種保護提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本試驗包括104個不同品種的甘薯材料（表1），分別來自安徽、北京、重慶、四川、山東、湖北、湖南、江蘇、河北、河南、江西、浙江、廣東等地。2018年種植于湖北省農業科學院糧食作物研究所試驗基地，2019年采取新鮮葉片進行試驗。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取及引物篩選? 參考Kim等[21]的方法，采用改良CTAB法提取甘薯基因組DNA。將提取的DNA在1.0%的瓊脂糖中進行電泳觀察，檢測DNA完整性;使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測量濃度和純度。將本研究中所用DNA模板的濃度稀釋到50～60 ng/μL，在–80 ℃的冰箱中保存，用于后續研究。參考王崇等[12]的cpSSR標記引物用于本研究，全部引物均委托武漢天一生物有限公司合成。

1.2.2? cpSSR擴增? PCR的反應體系為10×PAGE buffer（Mg2+）5 μL，dNTPs（10 mmol/L）4 μL，DNA（50～60 ng/μL）1 μL，Easy-Taq Polymerase（500 U/μL）0.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，加ddH2O補至總體積為50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸5 min，然后在4 ℃條件下保存5 min。擴增產物在0.5%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，電泳結束后銀染顯色，進行觀察。

1.3? 數據處理

人工記錄聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，對于同一引物的擴增產物，選擇大小合適、清晰明亮和分辨率高的條帶，同一位置有條帶的記為“1”，無條帶或條帶模糊的記為“0”，形成[0，1]的原始數據矩陣，輸入Excel 2016中，把圖形數據轉換為數字數據。利用軟件NTSYS-pc 2.1.0計算甘薯品種間的遺傳距離[22]，利用軟件MEGA 7.0.21的非加權平均數法進行聚類分析并生成甘薯品種的樹狀聚類圖[23];采用王紅意等[24]的方法構建甘薯品種的數字指紋圖譜。

2? 結果與分析

2.1? cpSSR多態性分析

用11對引物在104份甘薯材料基因組DNA中進行擴增，共擴增出58條條帶，多態性條帶為47條，平均多態性百分率為81.03%。每條引物平均擴增的條帶數為5.27，每條引物平均擴增的多態性條帶數為4.27。其中引物CPS18擴增得到的多態性條帶最多，為6條;引物CPS14擴增獲得的多態性條帶最少，為1條（表2）。

2.2? 聚類分析

使用11對引物將供試材料進行聚類分析，用軟件NTSYS-pc 2.1.0計算得到104個甘薯品種間的遺傳距離矩陣，每個甘薯品種間的遺傳距離為0.0386～5.2723，平均遺傳距離為0.2201，表明供試材料間的遺傳多樣性較為豐富。根據104個甘薯品種的遺傳距離矩陣，利用軟件MEGA 7.0.2的非加權平均數法進行聚類分析并生成104個甘薯品種的樹狀聚類圖（圖1）。從聚類樹狀圖可以看出，在遺傳系數為0.74時，可將104個甘薯品種分為5組。第1組包括‘阜紫薯1號和‘阜徐薯11號，2個品種的遺傳距離為0.171，表明親緣關系較近;第2組包括‘鄭紅21‘煙紫薯3號‘冀薯332等29個品種;第3組包括‘阜薯24‘阜徐薯20‘阜徐薯6號‘冀薯4號‘冀薯332‘冀薯99‘綿紫薯9號‘廣紫薯8號等64個品種;第4組包括‘寧Y76-3‘鄂薯6號‘贛GZ12-27‘渝紫薯7號‘鄂紫薯13‘渝薯50‘紅心王‘川紫薯4號等8個品種，其中‘贛GZ12-27與‘鄂紫薯13的遺傳距離最大（0.2086），‘紅心王與‘鄂紫薯13的遺傳距離最小（0.0386），品種間的親緣關系較近;第5組只有‘皖蘇311個品種。

2.3? DNA指紋圖譜構建

根據11對cpSSR引物的擴增結果對引物多樣性進行分析，綜合多方面的因素來構建甘薯品種的指紋圖譜。本研究選擇引物在每個品種對應的擴增結果作為參考指標，把擴增結果的有無構成一串以“0”和“1”組成的數字，每串數字表示1個甘薯品種的特征值，即為甘薯的“指紋圖譜”，從而構建104個甘薯品種的指紋圖譜（表3）。采用擴增結果較好的引物CPS4和CPS5來構建指紋圖譜。

3? 討論

甘薯是無性繁殖作物，放任授粉（集團雜交）是甘薯育種主要方法之一[25]，而集團雜交與甘薯的細胞質遺傳相關，表明基于葉綠體基因組開發的SSR標記在研究甘薯集團雜交后代上有一定的應用價值。

對104份普通甘薯的遺傳多樣性分析，結果顯示其遺傳多樣性豐富，試驗結果與Lee等[18]、Yang等[26]、趙冬蘭等[27]的研究結果基本保持一致，群體間的遺傳多樣性與多態性含量是相符的，遺傳多樣性的豐富程度與群體的遺傳背景相關，還與所設計的分子標記引物有關，本研究選用的cpSSR引物較少，可能與甘薯葉綠體基因組的特性有關，與核基因組相比，葉綠體基因組信息相對較少。采用分子標記進行遺傳多樣性分析，最終的結果可靠程度與標記引物的數量和質量密切相關。與王崇等[12]所采用的研究材料不同，品種數量不同，本研究所用的甘薯品種包括紫薯、淀粉型薯、鮮食型薯等類型的104個甘薯品種，遺傳分析結果更加準確。遺傳分析顯示，品種聚類結果與品種類型和標記無直接聯系，如‘商薯8號和‘蘇薯35被聚類在一起，‘皖薯373和‘寧紫薯1號被聚類在一起。聚類分析顯示，來自同一地區的品種被聚類在一起，如‘冀薯99和‘冀薯982，‘鄂紫薯13和‘鄂薯6號;具有相同親本或血緣關系相近的品種被聚在一起，如‘冀薯332和‘冀薯4號，‘阜菜薯1號和‘煙紫薯3號，聚類結果與羅忠霞等[28]的研究結果基本保持一致。‘皖蘇31被單獨聚在一組，與預期設想一致，表明cpSSR標記能夠較為準確地對甘薯品種進行聚類。cpSSR標記的聚類結果可在一定程度上反映甘薯的親緣關系，可為甘薯育種中高效選擇親本提供參考，在育種親本的選配時，宜優先考慮親緣關系遠、地理位置不同、遺傳背景差異大的優良品種。

DNA指紋圖譜具有高度的特異性、準確性和穩定性，能夠在分子層面分辨某一群體中生物個體間的差異，可避免因外界條件造成的干擾，有效鑒定種質資源和選擇育種親本[29]。李航等[30]通過開發cpSSR標記和nSSR標記對21份不同柑橘種質資源進行分析，結果表明cpSSR和nSSR結合使用可以比較準確地鑒定柑橘雜種;Singh等[31]開發cpSSR標記，并將其應用于劍蘭指紋圖譜的構建;Roullier等[32]結合cpSSR和nSSR標記，對329份甘薯品種進行分析，為甘薯馴化源于南美洲提供了證據，表明通過結合cpSSR和nSSR標記可有效研究種質資源。分子標記開發指紋圖譜是篩選不同植物品種的有效方法，指紋圖譜的構建一般采用特征譜帶法、引物組合法或核心引物組合法[33]。利用分子標記構建指紋圖譜的原則是選用較少的引物，獲得精確的鑒定結果。本研究選用的104個甘薯品種，主要來自江蘇、河南、安徽和湖南等地，甘薯品種類型主要是紫薯、食用型等，在構建指紋圖譜時，當選用引物CPS4和CPS5來構建104個甘薯品種的指紋圖譜時，只能有效區分‘鄭紅21‘浙紫薯3號‘渝紫薯73‘蘇薯16‘浙薯70‘萬薯9號‘皖蘇718‘皖蘇61‘皖蘇31和‘紅心王等10個品種，表明cpSSR分子標記可用于細胞質遺傳后代的研究，但是對具有相同或相似親本的甘薯品種進行指紋圖譜構建時，若要對甘薯品種進行更為準確有效地區分，可增加新引物或者結合nSSR等標記技術。

參考文獻

[161]?? 馬代夫， 李? 強， 曹清河， 等. 中國甘薯產業及產業技術的發展與展望[J]. 江蘇農業學報， 2012， 28（5）： 969-973.

[162]?? 劉洪明， 呂寶村， 王桂蓮， 等. 我國甘薯專業合作社存在的問題與發展對策——基于即墨市固定觀察點的調查與分析[J]. 安徽農業科學， 2020， 48（2）： 244-247.

[163]?? Yang J， Moeinzadeh M H， Kuhl H， et al. Haplotype-resolved sweetpotato genome traces back its hexaploidization history[J]. Nature Plants， 2017， 3（18）： 696-703.

[164]?? Selaocoe M E， Adebola P， Pillay M， et al. Genetic diversity of South African sweetpotato germplasm using molecular markers[J]. Journal of Crop Improvement， 2019， 33（6）： 814-833.

[165]?? 蘇文瑾， 趙? 寧， 雷? 劍， 等. 基于SLAF-seq技術的甘薯SNP位點開發[J]. 中國農業科學， 2016， 49（1）： 27-47.

[166]?? Zhao N， Yu X X， Jie Q， et al. A genetic linkage map based on AFLP and SSR markers and mapping of QTL for dry-matter content in sweetpotato[J]. Molecular Breeding， 2013， 32（4）： 807-820.

[167]?? 秦瑞英， 許? 學， 張立平， 等. 小麥SSR指紋圖譜及品種身份證的構建——基于毛細管電泳分析[J]. 中國農學通報， 2017， 33（34）： 46-55.

[168]?? Duan Y F， Liu J， Xu J F， et al. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis with simple sequence repeat markers of 217 potato cultivars （Solanum tuberosum L.） in China[J]. American Journal of Potato Research， 2019， 96（1）： 21-32.

[169]? 李樂晨， 朱國忠， 蘇秀娟， 等. 適于海島棉指紋圖譜構建的SNP核心位點篩選與評價[J]. 作物學報， 2019， 45（5）： 647-655.

[170]?? 胡文舜， 鄧朝軍， 許奇志， 等. 19個枇杷雜交新品種（系）的SSR鑒定和指紋圖譜構建[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2020， 28（2）： 153-162.

[171]?? 聶立圓， 李愛賢， 秦? 楨， 等. 基于SSR標記的132份甘薯種質指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報， 2018， 19（5）： 904-911.

[172]? 王? 崇， 王連軍， 蘇文瑾， 等. 基于cpSSR標記的甘薯品種親緣關系及遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種， 2020， 18（5）： 1687-1696.

[173]?? Yan L， Lai X J， Li X D， et al. Analyses of the complete genome and gene expression of chloroplast of sweetpotato [Ipomoea batata][J]. PLoS One， 2017， 10（4）： e124083.

[174]?? Martin G， Baurens F C， Cardi C， et al. The complete chloroplast genome of banana （Musa acuminata， Zingiberales）： insight into plastid monocotyledon evolution[J]. PLoS One， 2018， 8（6）： e67350.

[175]?? Ma J， Yang B X， Zhu W， et al. The complete chloroplast genome sequence of Mahonia bealei （Berberidaceae） reveals a significant expansion of the inverted repeat and phylogenetic relationship with other angiosperms[J]. Gene， 2013， 528（2）： 120-131.

[176]?? Zhang Y， Li L， Yan T L， et al. Complete chloroplast genome sequences of Praxelis （Eupatorium catarium Veldkamp）， an important invasive species[J]. Gene， 2014， 549（1）： 58-69.

[177]?? 王化坤， 婁曉鳴， 章? 鎮. 葉綠體微衛星在植物種質資源研究中的應用[J]. 分子植物育種， 2006（S1）： 92-98.

[178]?? Kyung Jun Lee， Gi-An Lee， Jung-Ro Lee， et al. Genetic diversity of sweetpotato （Ipomoea batatas L. Lam） germplasms collected worldwide using chloroplast SSR markers[J]. Agronomy， 2019， 9（11）： 752.

[179]?? Saxena S， Kaila T， Chaduvula P K， et al. Novel chloroplast microsatellite markers in pigeonpea （Cajanus cajan L. Millsp.） and their transferability to wild Cajanus species[J]. Australian Journal of Crop Science， 2019， 13（2）： 185-191.

[180]?? Yan Y D， Li X Y， Worth J R P， et al. Development of chloroplast microsatellite markers for Glyptostrobus pensilis （Cupressaceae）[J]. Applications in Plant Sciences， 2019， 7（7）： e11277.

[181]?? Kim S， Hamada T. Rapid and reliable method of extracting DNA and RNA from sweetpotato， Ipomoea batatas （L）. Lam[J]. Biotechnology Letters， 2005， 27（23）： 1841-1845.

[182]?? 賴恭梯， 賴鐘雄， 劉煒婳， 等. 福建中部3個野生蕉自然居群基于NTSYS和STRUCTURE軟件的ISSR分析[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（2）： 223-231.

[183]?? Kumar S， Nei M， Dudley J， et al. MEGA： A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences[J]. Briefings in Bioinformatics， 2008， 9（4）： 299-306.

[184]?? 王紅意， 翟? 紅， 王玉萍， 等. 30個中國甘薯主栽品種的RAPD指紋圖譜構建及遺傳變異分析[J]. 分子植物育種， 2009， 7（5）： 879-884.

[185]?? 王連軍， 雷? 劍， 蘇文瑾， 等. 2005～2014年甘薯品種國家鑒定情況分析[J]. 湖北農業科學， 2015， 54（12）： 2844-2846， 2849.

[186]?? Yang X S， Su W J， Wang L J， et al. Molecular diversity and genetic structure of 380 sweetpotato accessions as revealed by SSR markers[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（4）： 633-641.

[187]?? 趙冬蘭， 唐? 君， 曹清河， 等. 中國甘薯地方種質資源遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報， 2015， 16（5）： 994-1003.

[188]?? 羅忠霞， 房伯平， 李? 茹， 等. 基于EST-SSR標記的甘薯種質資源DNA指紋圖譜構建[J]. 植物遺傳資源學報， 2014， 15（4）： 810-814.

[189]?? Chen Y N， Dai X G， Hou J， et al. DNA fingerprinting of oil camellia cultivars with SSR markers[J]. Tree Genetics and Genomes， 2016， 12（1）： 1-8.

[190]?? 李? 航， 楊曉明， 丁德寬， 等. 基于cpSSR和nSSR標記的地方柑橘資源‘枳雀親本分析[J]. 果樹學報， 2018， 35（10）： 1161-1169.

[191]?? Singh N， Pal K A， Roy R K， et al. Development of cpSSR markers for analysis of genetic diversity in Gladiolus cultivars[J]. Plant Gene， 2017， 10： 31-36.

[192]?? Roullier C， Rossel G， Tay D， et al. Combining chloroplast and nuclear microsatellites to investigate origin and dispersal of New World sweetpotato landraces[J]. Mol Ecol， 2011， 20（19）： 3963-3977.

[193]?? 陳世軍， 張明澤， 姚玉仙， 等. 基于SSR標記的黔南茶樹種質資源DNA指紋圖譜構建[J]. 植物遺傳資源學報， 2017， 18（1）： 106-111.

責任編輯：沈德發