滇龍膽開花物候與交配系統研究

余成華 朱春艷 段紹鳳 楊秋雄 韓俊 梁艷麗

摘? 要：通過對滇龍膽的開花物候與交配系統進行觀測，統計不同處理的結實率和結籽率，分析滇龍膽開花物候與交配系統等繁育特征。結果表明：滇龍膽花期在10月中旬至12月中旬，單花花期持續17～19 d，單個花序花期可持續33～37 d，單株水平花期可持續8周，群體水平開花期持續時間為60 d以上，具有雌雄異位和雌雄異熟特征。滇龍膽雜交指數（OCI）值為5，花粉-胚珠比（P/O）值集中于（582.8±441.2）～（140 5.8±550.8）之間，結合人工授粉套袋試驗結果，證實滇龍膽的繁育系統類型為兼性異交型，部分自交親和，需要傳粉者，不存在無融合生殖。自然狀態下結實率較高，通過人工補充授粉，可顯著提高滇龍膽結實率。

關鍵詞：滇龍膽;雜交指數;交配系統;花粉胚珠比;開花物候

中圖分類號：S184????? 文獻標識碼：A

Flowering Phenology and Mating System of Gentiana rigescens

YU Chenghua1，2，3， ZHU Chunyan1，2，3， DUAN Shaofeng1，2，3， YANG Qiuxiong1，2，3， HAN Jun2，3，

LIANG Yanli1，2，3

1. Yunnan Agricultural University， National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasms Utilization & Innovation of Chinese Medicinal Materials in Southwest / Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Medici Plant Biology， Kunming， Yunnan 650201， China; 3. College of Agriculture and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： Through the observation of the flowering phenology and mating system of Gentiana rigescens， the seed setting rate and seed setting rate of different treatments were counted. The influence of flowering phenology and mating system on breeding was analyzed. The results showed that the florescence was from mid- October to the end of November， the florescence of inflorescence lasted for 33～37 days， the florescence of single flower lasted for 17～19 days， the florescence of single plant lasted for 8 weeks， and the florescence of population lasted for more than 60 days. The pollen was most active within 2～3 days of opening， and the stigma was inactive. The stamens developed completely and the pistils continued to grow after opening. The outcrossing index （OCI） was 5， which belonging to the heterozygous type. Some of them were self-compatible and pollination needed. The pollen ovule ratio （P/O） was between 582.8441.2 and 1405.8550.8. The breeding system belonged to the facultative heterozygous type. The seed setting rate was higher in the natural state， and there was asexual propagation. The seed setting rate could be significantly increased by artificial pollination.

Keywords： Gentiana rigescens; hybridization index; mating system; pollen-ovule ratio; flowering phenology

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.019

高山地區是植物生長的極端環境之一，高山植物繁殖過程面臨許多挑戰，低溫、傳粉限制、水和光照等都會影響其繁殖[1]，相對于其他植物，高山植物需要面對更加惡劣的氣候環境，植物需要更加頑強的適應機制來適應高山環境才能成功生存和繁殖。因此，高山植物的繁殖策略受到廣泛關注。有性生殖是有花植物繁衍的最重要方式。而開花時間即開花物候，因對植物授粉程度、傳粉者的訪花行為以及雌雄適合度等的影響，對植物繁殖交配的成功產生重要影響[2]。開花物候與環境條件之間的相互作用直接影響著植物交配系統[3]，如開花太早或太晚均會因為缺少有效的傳粉者而不能有效結實。

滇龍膽（Gentiana rigescens）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，為云南省道地藥材，分布于海拔1100～3000 m，是典型的高山植物。滇龍膽的盛花期在11月，恰在寒冷的冬季[4-5]，卻能夠適應環境成功繁殖。因此，對滇龍膽繁育特征的研究，有利于解析高山植物繁殖適應機制。同時，對滇龍膽開花物候特點和繁殖特征的研究，也為滇龍膽品種選育、高效栽培措施的制定提供理論依據和實踐基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗地點位于云南省臨滄市云縣漫灣鎮，屬云南省西南部，地理位置9943～10033 E，2356～2446 N，海拔2200 m，屬北亞熱帶氣候類型，年降雨量1367.2 mm，主要集中在7—9月;土壤以沙壤土為主。野外實驗于2018、2019年的10—12月進行。

1.2? 方法

1.2.1? 單花水平觀測? 隨機選取30株開單花的植株，在花朵未開放前，用記號筆和小標牌掛牌標記，花朵開放后，觀測單花形態變化并進行拍照記錄。每天早上、中午和傍晚各觀察一次，記錄數據。觀測單花開放狀態：花冠開裂時間、萎蔫時間、凋落時間、開花持續時間、開花高峰、單花花期、花藥變化、柱頭變化等。

1.2.2? 花序水平觀測? 隨機選擇即將開放的花序30朵，掛牌做標記，每天上午7：00進行觀察記錄，并照相。觀察記錄描述花序的開放狀態：始花時間、末花時間、花序1/2開時間、花序開放持續時間、小花開放順序、當天開放小花數、花序開放狀態、顏色變化、花序開放持續時間。

1.2.3? 單株水平觀測? 隨機選取滇龍膽30株，掛牌做標記，從第一朵單花開始開花（判斷花開放的標準是花瓣剛展開揚起）開始記錄，每天12：00觀察記錄一次，直至最后一朵單花敗落。每天記錄單花變化情況，始花期、開花高峰期、終花期、花序開放數、單株開花持續時間等。

1.2.4? 群體水平觀測? 采取直接觀測與詢問種植管理者相結合，記錄萌芽期、現蕾期、始花期、盛花期、花瓣凋謝期（判斷花朵枯萎的標準是花被變色、失去光澤、質地變軟）、開花高峰期、開花持續時間。

1.2.5? 花部形態特征觀測? 隨機選取完全開放單花30朵，用電子游標卡尺和直尺測量與其開花生物學相關的形態特征值，如花冠、花瓣、花萼、雌雄蕊各部分的長度、顏色、形狀等，并拍照記錄。

1.2.6? 花粉胚珠比（P/O）及雜交指數（OCI）? 花粉胚珠比（P/O）為平均單花花粉總量除以單花胚珠數。花粉計數方法為：隨機選取盛花期滇龍膽單花30朵，以單花為單位，將單花中的花藥全部取出，定容至1 mL，取5 μL統計所有花粉數，最后換算成單花花粉量。胚珠計數方法為：隨機選取30朵單花，將單花中的胚珠全部取出，定容至250 μL，取5 μL統計所有胚珠數，最后換算成單花胚珠數量，然后根據Cruden的標準評判交配系統類型;雜交指數（OCI）由3個花部特征（花序直徑、花朵大小及開花行為）決定，根據Dafni的標準進行測定、計算和評判[6]。

1.2.7? 人工交配處理? 在滇龍膽盛花期，隨機選擇長勢良好一致健康植株，每個處理至少30朵，重復3次。進行以下處理。（1）對照（CK）：不進行處理，自然授粉;（2）處理1（不去雄套紙袋）：用以檢測自發自交發生的機率;（3）處理2（去雄套紙袋，不進行授粉）：用以檢測是否存在無融合生殖現象;（4）處理3（去雄套網袋）：用以檢測是否存在風媒傳粉現象;（5）處理4（去雄不套袋）：用以檢測傳粉昆蟲對生殖的貢獻;（6）處理5（同株同花授粉）：檢測自交親和性;（7）處理6（同株異花授粉）：保留即將開放小花去雄套袋，等柱頭可授性最高時，再授以同株異花的花粉，套袋;（8）處理7（異株異花授粉），檢測異交親和性。所有的去雄工作均在花藥未散粉時進行，人工授粉時先采集散粉的花粉，用毛筆蘸取花粉后或用鑷子直接涂抹至柱頭上。試驗期間，對套袋的花朵經常進行檢查，揭袋換氣，防止霉變。授粉2個月后檢測各處理結實率和結籽率，翌年1月采集果實，統計種子數，計算平均每果實種子數。

1.3? 數據處理

采用SPSS 22軟件處理系統進行數據Duncans檢驗、差異顯著性分析，Microsoft Office Excel 2010軟件進行數據錄入，用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2? 結果與分析

2.1? 單花開放動態觀測

如圖1所示，單花花期經歷了萌芽到出現花蕾，到花冠完全開放，花藥完全開裂散粉，花藥脫落，花絲萎蔫，柱頭伸出花冠，花冠萎蔫，子房膨大等一系列過程，單花開花物候期持續17～19 d。單花萌芽期持續4～6 d（圖1A），花冠緊縮閉合，且在這個時期雄蕊發育高于雌蕊;現蕾期持續6 d（圖1C～圖1D），花苞逐漸伸長至出現紫紅色，雌蕊和雄蕊也逐漸伸長;始花期持續2 d（圖1E），花冠微微開裂至1/2花冠;盛花期持續3 d（圖1F、圖1G），雄蕊的花粉囊逐漸開裂至花粉完全散出，雌蕊逐漸伸長至高于雄蕊，柱頭開始開裂伸長至高于花冠;花瓣凋零期持續2 d（圖1H），花冠開始閉合到完全閉合，直至萎蔫，但不脫落。雄蕊脫落，子房膨大。上述結果表明，滇龍膽的單花從花芽到花朵開放需要經歷14 d的發育，花朵開放后經歷5～6 d的盛開期完成傳粉受精，之后花冠枯萎，包裹在發育的子房表面。子房進一步完成下一階段種子的發育。

2.2? 花序開放動態觀測

滇龍膽花屬于聚傘花序，如圖2所示，一般由1～4個花序組成，每個植株花序有小花5～25朵或是更多，花序花期可持續33～37 d。花序從10月底進入花蕾期，花蕾期可持續10～14 d，到11月中旬進入盛花期。由花序每天開放的小花數可知，以花序為單位的開放持續時間為16～ 18 d，其中在花序開始開花第11～19 d是花序開花的高峰期，其開花的花數量最多，之后開放花數逐漸減少（圖3）。花序水平上，花朵的開放一般從頂端開始，然后依次向下;先開放的單花也最先凋落。

2.3? 單株開放動態觀測

通過對滇龍膽單株花序持續觀測發現，滇龍膽的單株有1至多個花序，小花多數，單株水平花期可持續8周（圖4）。從11月進入開花期，至12月末全株小花凋謝。在整個開花期間，側枝花蕾不斷長出，花序不斷開放。單株開花高峰期為開花第4～6周，每天開放花序數為1～2朵，之后開放花序逐漸減少，直至單株花序上花朵完全開放。

2.4? 花部形態特征觀測結果

滇龍膽花呈錐狀桶形或寬桶形（圖5），花朵由花冠、萼片、雄蕊和雌蕊組成;花朵開放時花冠頂端分裂張開，呈五角星形，花冠長度在2～ 2.5 cm之間，花冠顏色呈紅紫色或藍紫色。通過對滇龍膽花朵整個發育階段的觀測，測量了各個階段花朵的雄蕊長、雌蕊長、花苞長、小總花苞長和萼片長;從雄蕊和雌蕊的測量結果（圖6、圖7）來看，研究發現花朵的發育有雌雄異位現象，在現蕾期以前，雄蕊長度都顯著長于雌蕊;特別是在萌芽初期雄蕊長度（1.0±0.1）cm，雌蕊長度（0.5±0.1）cm，雄蕊的長度是雌蕊的2倍。之后的現蕾期雄蕊長度發育減緩，雌蕊迅速發育，直到始花期（圖6E），雄蕊和雌蕊發育長度趨于一致，長度在（1.65±0.1）cm，此時雄蕊發育完全，花藥發育飽滿;在盛花期（圖6F、圖6G）雌蕊會進一步發育生長，最終長于雄蕊，此時柱頭具有可授性，可以完成傳粉受精過程。在之后的發育中，柱頭完成受精，雌蕊下部子房發育膨大;雄蕊花藥和花絲枯萎最終脫落。花苞的發育在完成受精前都是一個逐漸生長的過程（圖7），在發育到15 d時生長減緩長度在（3.6±0.1）cm。小總花苞長和萼片長度發育均緩慢生長，在發育到15 d時長度分別為（1.2±0.1）cm和（0.9±0.1）cm。

2.5? OCI值

由表1可看出花朵直徑集中在（15±1）mm～ （16.67±1.15）mm之間（>6 mm，記為3）;對花藥開裂與柱頭可授性時間間隔的觀測結果發現，花藥先開裂，柱頭后生長伸出花冠（圖6E）;研究發現開花第2天花粉活力最高，開花3～4 d后柱頭才具有可授性，所以滇龍膽花朵的發育屬于雄先熟（1）類型;在進一步的觀測中，研究發現單花開放當天，隨著柱頭伸出花冠，花藥遠離柱頭，之后花藥開裂散粉脫落，與柱頭沒有接觸，柱頭與花藥在空間上是分離的，雌蕊和雄蕊的空間間隔在（2.33±0.29）mm～（3.33±1.15）mm之間，即定義雌雄蕊器官在空間上存在分離，記為1。雜交指數（OCI）值為5，根據Dafni標準，滇龍膽屬于異交型，部分自交親和，需要傳粉者。

2.6? P/O值

滇龍膽的P/O測定結果見表2。由表2可知，單花花粉量平均于（976675623）～（12940018543）之間，單花胚珠數為（9620）～（16079），則P/O值集中于（582.8441.2）～（1405.8550.8）之間。根據Cruden[7]的評判標準，滇龍膽的繁育系統類型屬于兼性異交型。

2.7? 交配系統的測定結果

通過人工授粉套袋等處理對滇龍膽交配系統進行驗證（圖8）。結果表明，在自然條件下，滇龍膽的結實率和結籽率分別為90%和75.27%，說明滇龍膽交配系統對高山環境適應較好;去雄套紙袋結實率10%、結籽率1.77%，顯著低于自然對照，說明滇龍膽不存在無融合生殖現象。而同株異花授粉滇龍膽結籽率高達82.71%，顯著高于自然對照，說明滇龍膽具有高度的自交親和特性。不去雄套紙袋隔離昆蟲傳粉的處理，其結實率和結籽率顯著降低，分別為43.00%和17.88%，說明滇龍膽雖然自交親和，自發自交現象出現頻率極低，需要傳粉者為其傳粉才能結實。去雄套網袋的結實率和結籽率分別為12.44%和1.77%，而去雄不套袋具有較高的結實率和結籽率，分別為83.33%和86.47%，說明為滇龍膽花朵傳粉方式可能是蟲媒傳粉，風媒傳粉率低。滇龍膽自然條件下的結籽率為75.27%，而通過同株異花授粉和異株異花授粉后，結籽率顯著提高至81.24%和93.67%，說明人工補充授粉，可顯著提高其結籽率，說明自然條件下滇龍膽存在花粉限制。

3? 討論

開花過程是植物生長和繁殖的關鍵階段[8-9]。滇龍膽花屬于聚散花序，其頂端先開放，依次向下進行，從而延長了花期，增加授粉時間，從而提高授粉幾率[10]。滇龍膽花期主要集中在10月中旬至12中旬;整個花序花期可長達30 d以上，單花花期在19～21 d，單花從萌芽到花朵盛開需要15 d。植物對其傳粉者的吸引主要集中在花部特征上[11-12]，滇龍膽花朵呈錐狀桶形或寬桶形，昆蟲進入花內基部舔舐花蜜時可將身上大量花粉散播到柱頭上，完成授粉;開放后花萼呈五角星形，且顏色呈紫紅色和藍紫色有利于吸引傳粉昆蟲。

研究發現，滇龍膽雌蕊和雄蕊存在雌雄異位的現象，并且雄蕊比雌蕊先熟，表現出雌雄異熟。滇龍膽花開放后雄蕊不再生長，而雌蕊繼續生長，柱頭從花藥上方伸出，隨后頂端分成2裂，柱頭的2裂彎曲，改變了花中雌蕊的位置以及柱頭和花藥之間的相對距離[13]。滇龍膽花雌雄的成熟在時間上的分離以及雌蕊和雄蕊在空間上的異位，降低了自花授粉的可能性，促進異株異花授粉，從而增強其后代的環境適應能力[14-16]。完成受精后花萼逐漸閉合，雌蕊下部的子房膨大發育。通過對授粉后滇龍膽花朵的持續觀測，發現滇龍膽花冠枯萎后并不會脫落，而是緊緊閉合包裹著內部已經完成授粉的雌蕊，包裹的花被可以保護子房不受低溫的侵害，這種進化的特征或許就是滇龍膽能夠成功適應高山環境的關鍵原因。

通過雜交指數和花粉胚珠比的測定，發現滇龍膽花屬于兼性異交型;人工輔助授粉試驗結果顯示滇龍膽繁育方式以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者，不存在無融合生殖。自然狀態下滇龍膽的結籽率可達75.27%，說明其異交傳粉機制有效。而在不去雄套袋的自花授粉情況下結籽率為16.29%，說明在極端缺少傳粉者情況下，物種會保持一定的自花傳粉來維持物種的生存與繁衍[17]。滇龍膽柱頭在開花后會分裂成2裂并向外彎曲，增大觸及花粉的可能性，無處理套袋結實率為41.67%也證實了這一點。

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責任編輯：白? 凈