橄欖種子休眠生理與層積效應

葉清華 王威 謝倩 陳清西

摘? 要：探究橄欖種子休眠生理與層積對種子萌發和幼苗生長的影響效應，為橄欖及其他核果類果樹種子休眠生理研究和種苗繁育提供參考。以未層積種子（層積0 d）為對照，對橄欖種子進行不同時間（每10 d一處理，共10個處理）的層積處理，研究橄欖種子在層積過程中營養物質、激素水平等生理生化變化，以及不同層積時間種子的萌發和幼苗生長情況。結果表明：層積處理縮短了橄欖種子發芽啟動時間，對橄欖種子萌發均有促進作用。層積90 d和100 d的橄欖種子發芽率最高，均為82.22%，比CK種子（53.33%）高54.17%，發芽指數也顯著高于其他處理時間，層積100 d的橄欖種子發芽指數是CK的8.5倍（P<0.05）。層積能提高橄欖幼苗地上部生物量，以90、100 d處理的橄欖幼苗生長最好。橄欖種子的主要營養貯藏物質是粗脂肪（70.85%～81.67%），在層積過程中呈先升后降的趨勢。新鮮橄欖種子（CK）中ABA含量較高（16.64 ng/g），而GA3未檢測到。隨層積時間延長，ABA與SA含量快速下降，GA3含量增加，IAA/ABA升高，利于種子休眠解除。層積處理橄欖種子有利于其營養物質達到萌發所需水平，加快內源激素變化，促進種子發芽和幼苗地上部生長，以層積90～100 d最佳。

關鍵詞：橄欖;層積;內源激素;營養物質;休眠;發芽

中圖分類號：Q945.35;S667.5????? 文獻標識碼：A

Dormancy Physiology and Stratification Effects of Chinese Olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] Seeds

YE Qinghua， WANG Wei， XIE Qian， CHEN Qingxi

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： The objective of the work was to explore the dormancy physiological of Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] seeds and the effects of stratification on seed germination and seedling growth， and to provide references for seed physiology research and seedling breeding of Chinese olive and other stone fruit trees. Unstratified seeds （stratified for 0 d） were used as the control （CK）， and the relevant indicators of the seeds with different stratification treatments （every 10 days as a treatment， a total of 10 treatments） were determined to study the physiological and biochemical changes of nutrients， hormone levels， the germination， and seedling growth. Results showed that the stratification treatment could shorten the initiation time of germination， different stratification treatments promoted the germination of Chinese olive seed. The germination rate of the stratified seeds was significantly higher than that of the unstratified （CK） seeds. The germination rate of the Chinese olive seeds with 90 d and 100 d stratification was the highest （82.22%）， which was 54.17% higher than that of CK （53.33%）. The germination index of 90 d and 100 d stratification was also significantly higher than that of other treatments. The germination index of stratified for 100 d was 8.5 times that of the CK seeds （P<0.05）. By considering the growth of the Chinese olive seedlings， the stratification treatment could improve the biomass of the aboveground part. The Chinese olive seedlings with 90 d and 100 d stratification treatment grew best. The main nutrient storage substance of Chinese olive seed was crude fat （70.85%～81.67%）， which tended to rise first and then fall during the stratification process. ABA content in the fresh Chinese olive seed was the highest （16.64 ng/g）， while GA3 was not detected. With the prolongation of the stratification time， the content of ABA and SA decreased rapidly， while the GA3 content and IAA/ABA increased， which was beneficial to the release from seed dormancy. As a result， stratification is advantageous for Chinese olive seeds to reach the required nutritional level for germination， accelerate endogenous hormone changes， promote seed germination and aboveground part growth of seedlings， and 90～100 days stratification treatment for C.album is the best solution for practical seedling breeding.

Keywords： Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.]; stratification; endogenous hormone; nutrient substance; dormancy; germination

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.020

橄欖[Canarium album （Lour.） Raeusch.]為分布于熱帶、亞熱帶地區的常綠果樹[1-2]，果實富含酚類化合物和萜類物質，在抗氧化、清除自由基、抑菌、抗病毒方面作用顯著[3-5]。目前，橄欖砧木培育多為實生繁育，種子存在明顯的休眠期，生產上通常采用橄欖果實自然腐爛或對種子進行層積處理，破除休眠。研究表明，未層積或置于自然通風處的橄欖種子出苗率僅為36.3%和4.5%，自然腐爛或層積后的橄欖種子發芽率可達76.7%和69.3%[6-7]。橄欖種子存在發芽率低，對脫水敏感，幼苗出苗時間不一致、長勢參差不齊等問題[7]，極大地限制了橄欖的種苗繁育和品種選育進程。

種子休眠是植物在長期進化中形成的一種生態適應性，但在生產上卻降低了種子的利用價值，播種時休眠會降低種子發芽率、影響出苗整齊度，并嚴重制約大規模常規育種和種苗生產[8-9]，尤其是核果類果樹等的種子，如何解除果樹種子休眠是當今生物學和農學研究的熱點之一，而種子休眠的生理機制更是被眾多研究者關注。層積處理是解除休眠最常用的方法，使種子在此期間內完成一系列生理變化和后熟過程，縮短發芽時間，提高發芽整齊度和發芽率，如桃[10]、核桃[11]、開心果[12]、蘋果[13]、黃櫨[14]、茶樹[15]等的種子利用低溫層積處理催芽較為有效。

目前，橄欖種子在實際生產中采用冬季層積處理，翌春播種。然而，其休眠期間的生理生化變化尚不明確，且不同層積時間對種子萌發及種苗生長是否有影響亦不得而知。故本研究對橄欖種子進行濕沙層積，研究橄欖種子在層積過程中的休眠生理及層積對種子萌發和幼苗生長的效應，旨在了解橄欖種子休眠解除的生理代謝及萌發特性，對橄欖實生繁育及種苗生產具有重要意義，亦能為其他果樹種子的休眠生理研究等提供一定參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以福建省橄欖主栽品種‘長營為試材，采集11月份成熟果實，剔除病蟲果、畸形果，取出種子洗凈備用。

1.2? 方法

1.2.1? 層積處理? 于2015年11月至2016年4月在設施大棚內進行模擬冬季層積處理試驗，當地日氣溫如圖1所示。在長寬高=1.2 m1.2 m 1.0 m的木箱內，以含水60%的河沙（用手緊握河沙，可成團而不滴水為度）進行種子層積。木箱底部有透水孔，底層沙厚20～30 cm;頂層沙厚20～30 cm，覆蓋薄膜;中部為蒸餾水吸脹（24 h）后的橄欖種子1層、河沙1層，如此相間堆放5～7層。層積期間，及時噴水保濕。于層積0 d（對照，CK）、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 d取出種子，洗凈。其中敲取至少200顆果核內的種胚，液氮處理后，保存于?80 ℃冰箱，用于相關指標測定，重復3次;另取90顆平播于苗床河沙中，覆沙2 cm，萌發期間，保證種子的光照、澆水等管理措施一致，田間持水量為70%～ 80%。觀測記錄不同層積時間橄欖種子萌發情況，計算發芽啟動時間、發芽持續時間、發芽率、發芽指數。發芽結束20 d后，取正常生長的幼苗10株，測定幼苗生長量。每處理3次重復。

1.2.2? 橄欖種子萌發及幼苗生長指標測定? 發芽啟動時間為種子播種到第一顆種子開始萌發所需時間，發芽持續時間為第一顆種子開始萌發至發芽結束時的總天數[15]。由于橄欖種子具有0～4個胚[17]，能萌發0～4株幼苗不等，故只要種子有一胚軸伸出土時，即認定該種子為發芽種子。當連續3 d每天的發芽率不超過重復粒數1%時即認為發芽結束。發芽率是衡量種子發芽能力的指標，發芽指數是種子活力指標，分別按以下公式計算[18]：

發芽率（GR，germination rate）=n/N100%

發芽指數（GI，germination index）=（Gt/Dt）

其中，n為發芽種子數，N為供試種子數，Gt為t日內的發芽數，Dt為相對應的種子發芽天數。

橄欖幼苗株高、莖粗分別用尺子、游標卡尺進行測量;葉面積采用掃描法測量;用電子天平測定地上部和地下部根系鮮重。

1.2.3? 橄欖種子營養物質含量的測定? 種子可溶性總糖（蒽酮比色法）、可溶性蛋白質（考馬斯亮藍法）、粗脂肪（索氏提取法）含量測定參照王學奎[19]的方法。

1.2.4? 橄欖種子內源激素含量的測定? 內源激素赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、生長素（IAA）、水楊酸（SA）含量采用超高效液相色譜質譜法（UPLC-MS）測定。

（1）激素提取：將種子樣品用液氮研磨，加入70%甲醇和同位素內標激素，4 ℃超聲提取30 min，上清液離心濃縮后，用Oasis MCX柱進行固相萃取，萃取樣品進行上機測定。

（2）測定：采用Waters XEVO-TQS高效液相色譜儀進行測定，色譜柱為Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm 1.7 μm）;柱溫：40 ℃;流動相A：5 mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B：甲醇;洗脫程序：0～13 min，5%～100%B;13～17 min，100%B;17～20 min，100%～5%B;進樣體積：5 μL;流速：0.3 mL/min。條件如下：正離子模式參數：毛細管電壓1.00 kV;錐孔電壓30 V;離子源溫度150 ℃;錐孔氣流量150 L/Hr;脫溶劑氣流量800 L/Hr;脫溶劑氣溫度400 ℃。負離子模式參數：毛細管電壓1.00 kV;錐孔電壓30 V;離子源溫度150 ℃;錐孔氣流量150 L/Hr;脫溶劑氣流量800 L/Hr;脫溶劑氣溫度400 ℃。

1.3? 數據處理

數據采用Excel 2016軟件處理，Graph prism 7.0軟件制圖，利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差（ANOVA）分析，用LSD檢驗法對顯著性差異（P<0.05）進行多重比較，數據表示為平均值標準誤差。

2? 結果與分析

2.1? 層積處理對橄欖種子萌發的影響

由不同層積處理的橄欖種子萌發時間（表1）可知，發芽啟動時間隨層積時間增加而縮短。層積時間越長，則發芽啟動所需時間越短，層積100 d種子，播種后15 d開始萌發，比0 d種子縮短了105 d。而各處理發芽持續時間差異不大（25～30 d）。將層積時間與萌發啟動時間相加，即萌發啟動所需總天數，以層積至發芽結束的時間為橫坐標，觀察不同處理的種子萌發過程（圖2），可知，橄欖種子從層積處理需經過115～125 d開始萌發，145～150 d萌發結束。其中，層積60、80、90、100 d處理的種子在145 d即可提早結束發芽，且具有較大出苗數（>80株）。從萌發過程看，層積90、100 d出苗時間短而集中，具有較好效果。

由圖3可知，層積處理10～100 d對橄欖種子萌發均有促進作用，萌發率顯著高于CK種子。其中，層積90 d和100 d的發芽率最高，均為82.22%，比CK（53.33%）高出54.17%。由于橄欖種子發芽啟動天數較長，故發芽指數較一般種子低，僅為0.15～1.29，但隨著層積時間增加，發

芽指數逐漸上升。層積90、100 d時，發芽指數迅速升高，顯著高于其他時期（P<0.05），100 d時達最高，為CK的8.5倍，表明該時期的種子活力高。

2.2? 層積處理對橄欖種苗生長的影響

不同層積時間橄欖種苗生長情況如表2，幼苗株高在10.96～12.78 cm范圍內，以層積70、90、100 d最高，顯著高于CK（P<0.05）;不同處理幼苗莖粗在1.69～2.11 mm范圍內，總體差異不大;而幼苗葉面積、地上部鮮重均以層積100 d最大，分別比CK高出45.13%、31.57%（P<0.05）;而層積時間長短對地下部生長影響不大。表明，層積處理能提高橄欖幼苗地上部生物量水平，以100 d處理的橄欖幼苗生物量最多，植株生長最好，而90 d與100 d處理的幼苗總體差異不顯著。

2.3? 層積過程中橄欖種子營養物質變化

糖類、蛋白質和脂肪是種子休眠解除和萌發的重要營養來源，由圖4可知，橄欖種子主要貯藏營養物質為粗脂肪，含量達70.85%～81.67%。層積過程中，其可溶性糖含量相對穩定;而蛋白質含量整體處于升-降-升-降趨勢，層積50 d時最高，顯著高于50 d之前（P<0.05），比新鮮種子（0 d）的蛋白含量高出21.36%，而后下降。粗脂肪隨層積時間延長呈先升后降趨勢，層積50 d時，含量最高，比新鮮種子（0 d）顯著高出15.27%，隨后呈現逐步降低趨勢。

2.4? 層積過程中橄欖種子內源激素的變化

植物激素在種子的休眠與萌發中起到重要作

用，由圖5可知，新鮮橄欖種子中ABA含量較高（16.64 ng/g），分別是IAA、SA的43.29、3.74倍。隨層積時間延長，ABA與SA趨勢相同，含量快速下降后趨于平緩。ABA與SA含量降低，解除了其對橄欖種子休眠的抑制作用。而IAA含量總體較低，首先下降，后期波動變化。新鮮種子未檢測到GA3，而層積過程中GA3含量變化為雙峰趨勢，層積30 d、90 d時具有極大值。

種子休眠解除與否除了與激素的絕對含量有關外，也與激素間的平衡有關[20]。由圖6可知，層積過程中，SA/ABA表現為先升后降再升趨勢，而IAA/ABA整體呈上升趨勢，有利于種子休眠解除;GA3/ABA與GA3趨勢相近，在層積30 d及90 d時有極大值。

3? 討論

層積處理是一種廣泛使用且有效的打破種子休眠的方法，層積處理期間，種子抑制物含量下降，營養物質達到一定水平，種胚發育后熟，有助于打破桃[10]、蘋果[13]、歐洲李[21]等核果類果樹種子的生理休眠，為發芽提供了有利條件。本研究表明，層積處理能在不同程度上提高橄欖種子發芽率，但不同層積時間對發芽率影響各有不同，以層積90 d、100 d處理最高（82.22%），比未層積（53.33%）的種子高出54.17%。對發芽指數影響更為明顯，表明層積時間越長，種子活力越高。雖然層積10 d與層積100 d的種子發芽率差異不顯著，但層積100 d種子發芽指數顯著高于層積10 d的種子，且發芽啟動天數縮短了96 d，表明層積100 d的橄欖種子發芽集中、迅速而整齊。層積處理對幼苗株高和葉面積有一定促進作用，從而增大了地上部鮮重，層積90 d、100 d處理效果較好。層積時間越長，發芽啟動所需時間越短，表明層積處理能加快橄欖種子發芽啟動。本試驗是模擬冬季層積，與實際貼合，可為生產實踐提供一定參考。對于休眠機理方面，雖控制所有種子的溫濕及管理條件一致，但可能涉及的生物鐘和溫周期效應應在未來研究中加以深入。

層積的濕沙環境給橄欖種子提供了一個繼續完成生理后熟的環境條件，有利于大分子營養物質進行水解與轉化。碳水化合物、蛋白質和脂質等主要貯藏物質是大多數種子休眠解除，促進萌發生長必需的營養物質和幼苗早期生長的能量來源[22]。當種子從休眠狀態進入吸脹萌動階段，細胞內部發生一系列生理生化變化，生長首先動用胚或胚軸中的可溶性糖和蛋白質，而后貯藏組織中的大分子物質（貯藏蛋白、脂肪等），在其相關代謝酶（蛋白酶、脂肪酶等）的催化作用下被分解成可溶性小分子，然后輸送到胚的生長部位被繼續分解和利用。而種子貯藏物質對休眠解除和萌發的影響取決于儲備量和植物種類，如藜、苜蓿種子的發芽與可溶性糖含量正相關[23]，蛋白質在豆科植物種子萌發期間起動員作用[24]，向日葵種子萌發期間，油酸和蛋白質含量均顯著降低[25]。層積對種子內部營養代謝環節方面有很好的促進作用[26， 27]。成熟和休眠的種子中存在貯藏油脂分解代謝所需的多種酶，在擬南芥和油菜種子發育過程中，脂質顯著分解，在種子成熟最后階段，油含量下降，控制種子休眠進程[28]。而脂肪水解釋放出脂肪酸和甘油，并經歷進一步的分解代謝以提供能量和碳骨架用作呼吸的底物，促進種子發芽生長。橄欖種子生理代謝物質以脂肪為主，其他物質含量較低。被子植物種子的主要貯藏脂類是三酰基甘油（Triacylglycerols，TAGs），是碳源和能量的高效儲備來源，為種子發芽提供能量。種子TAGs合成于質體外，可能與內質網和油體有關，而脂肪酸則在質體中合成，質體中產生的脂肪酸并不總能立即用于TAG的生物合成。而且，對于不同物種，油體在種子不同組織中的豐度和位置也有很大差異[29， 30]。本研究層積處理早期，橄欖種子粗脂肪含量首先上升，可能與油體位置和脂質在種子不同部位間的轉移有關，或新鮮種子中的游離脂肪酸含量較高，層積處理前期先將脂肪酸轉化為TAGs進行貯藏，完成生理后熟作用。后續可測定游離脂肪酸、脂肪合成酶、酰基轉移酶等相關酶活性進一步深入研究。

植物激素參與種子休眠與萌發的調控，如萌發促進物質赤霉素、細胞分裂素和萌發抑制物質脫落酸之間的相互作用決定種子的休眠與萌發，愈來愈多研究表明種子休眠不僅由多種激素調節，也與激素間的平衡關系以及細胞對激素的敏感性有關[31-34]。其中，ABA和GA是主要激素，ABA/GA平衡決定了種子命運，高內源ABA和低水平GA導致種子休眠和出苗率低，ABA參與GA生物合成的抑制作用，而GA也負反饋調節ABA生物合成[35]。種子不同組織部位在決定發芽方面具有不同作用，ABA主要在胚乳中產生，然后由特定轉運蛋白輸出到胚中，而休眠解除期間GA由胚產生，引發儲存在種子中的碳水化合物分解代謝[32]。因此，種子中的激素水平不僅取決于激素的生物合成和分解代謝，也與激素及其前體在種子中不同組織部位的轉運有關。在橄欖種子中，高濃度ABA及低濃度GA是導致其休眠的主要因素，新鮮種子含有豐富的ABA，而未檢測到GA3。層積處理促進了萌發促進性激素（GA3）水平的提高，降低了萌發抑制性激素（ABA、SA）含量，增大GA3/ABA、IAA/ABA，提高了種子激素代謝活動。隨層積時間延長，ABA降低，為其他內源激素發揮作用提供環境條件。而GA濃度在整個層積過程中呈現雙峰趨勢，可能與其生物合成基因GA3ox及信號傳導的DELLA蛋白等有關[36]。研究表明，生長素IAA與ABA信號通路發生串擾[37]，橄欖種子層積后期，IAA含量波動變化，而IAA/ABA隨著層積時間的延長呈上升趨勢，對萌發具有促進作用，與紅豆杉種子相類似[27]。SA是一種與各種防御途徑相關的植物激素，能夠抑制種子發芽[38]。層積后的橄欖種子SA與ABA變化趨勢相同，SA的降低使種子休眠得到解除。除了植物激素外，其他內源信號因子如活性氧（ROS）[39-40]、一氧化氮（NO）[13]和光[41]、溫度[42]等環境因子也會影響ABA和GA之間的平衡，進而影響種子的休眠和萌發。

4? 結論

橄欖種子主要貯藏的營養物質為粗脂肪，高濃度ABA和低濃度的GA3導致了種子休眠。層積處理有利于橄欖種子營養物質提高達到萌發所需水平，促進內源激素轉化，利于種子萌發;同時，對橄欖幼苗地上部生長具有一定促進作用。與未層積相比，層積處理90、100 d能加快橄欖種子發芽啟動，提高發芽指數，使種子發芽迅速而整齊，幼苗生長效果最佳。從實際生產的角度考慮，對橄欖種子先進行層積處理90～100 d后再播種，與直接播種相比，能夠節約管理成本與勞動強度，是橄欖實生苗繁育及種苗生產較為便捷有效的措施。

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