菠蘿蜜葉綠素缺失突變體幼苗莖的解剖結構

董俊娜 謝柳青 楚文清 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 瞿倩

摘? 要：木本植物莖的發育在木材形成中具有重要意義。以菠蘿蜜葉綠素缺失突變體幼苗（Chlorophyll deficient mutant， CDM）為研究材料，選取正常幼苗作為對照（Control check， CK），觀察并測量其株高和基部莖粗。使用石蠟切片法和光學顯微技術對莖各節間進行觀察，測量木質部、韌皮部、表皮和周皮的厚度，比較CDM與CK之間的差異。結果顯示，CDM的株高和基部莖粗的增長受到一定的抑制，各節間木質部、韌皮部以及周皮的厚度均減小;相比次生木質部，次生韌皮部的抑制作用更顯著。

關鍵詞：菠蘿蜜;葉綠素缺失突變體;莖;解剖結構

中圖分類號：S667.8????? 文獻標識碼：A

Structural Analysis of the Stem of the Chlorophyll Deficient Mutant from Artocarpus heterophyllus Seedlings

DONG Junna1， XIE Liuqing2， CHU Wenqing1， YU Xudong1， CAI Zeping1*， LUO Jiajia2，3， QU Qian1

1. College of Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： The stem development of woody plants plays an important role in wood formation. In this study， the seedlings of the chlorophyll deficient mutants （CDM） of Artocarpus heterophyllus were selected as the research material and normal seedlings were selected as the control check （CK） to observe and measure plant height and basal stem diameter. The internodes of seedlings were observed by paraffin section and optical microscopy. The thickness of xylem， phloem， epidermis and periderm were measured， and the difference between CDM and CK was compared. The results showed that the increase of plant height， basal stem diameter of CDM were inhibited to some extent， and the thickness of xylem， phloem and periderm of each internode decreased. Compared with the secondary xylem， the inhibition of secondary phloem was more significant.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; stem; anatomic structure

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.021

莖在植株中起到支撐和運輸的重要作用，且在木材形成過程中具有重要意義[1]。木本植物莖的生長包括初生生長和次生生長兩部分。初生生長發生在莖的幼嫩組織中，莖頂端分生組織細胞的分裂和伸長共同決定了莖的伸長，使植株長高。在此過程中，產生初生木質部和初生韌皮部，并分化出表皮。次生生長在初生生長完成之后發生，此時維管形成層分別向內、向外產生次生木質部和次生韌皮部，同時周皮取代表皮，于是莖不斷增粗[2-3]。

光合作用為綠色植物的生長發育提供必要的物質和能量[4-5]。葉綠素是光合作用的重要色素，在光能的吸收、傳遞和轉換過程起著重要的作用[6-7]。葉綠素缺乏會導致植物對光能的利用率下降，從而影響其正常的能量供應，在植物外觀形態上表現為葉片及莖出現黃化或白化現象[8]。白化現象在植物界中普遍存在，但是目前的研究大多在草本植物中開展，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、小麥（Triticμm aestivμm）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）等[9-12]，對于木本植物的研究相對較少[13]。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus）是一種珍貴的木材樹種[14]。本課題組在野外考察中發現菠蘿蜜葉綠素缺失突變體（chlorophyll deficient mutants， CDM），利用其母株成熟果實中的種子進行栽種，分離得到子代CDM幼苗，作為實驗材料進行深入研究。付影等[15]對菠蘿蜜CDM形態和生理進行了研究，結果表明CDM的莖粗減小。鄭李婷等[16]和謝柳青等[17]分別對CDM嫩莖和次生生長莖進行了轉錄組分析。然而莖中各節間的解剖結構還未知。本研究通過石蠟切片法和光學顯微鏡技術，觀測并比較CDM莖中各節間的結構變化，分析菠蘿蜜CDM莖的發育，為木本植物莖發育的研究提供新的思路。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采用謝柳青等[17]的實驗材料，母株為具有隱性葉綠素缺失遺傳基因的植株，從母株的成熟果實中剝離出種子，挑選飽滿的種粒種植于含有營養土的花盆中，在光照和水分充足的條件下栽種，通過栽種分離出完全白化的CDM幼苗，選取正常幼苗作為對照（CK）。

1.2? 方法

1.2.1? 株高、基部莖粗測量? 待種子萌發后，分別對苗齡1、5、10、15、20、25、30、35、40 d的CDM及CK的株高和基部莖粗進行觀察和測量，并拍照記錄。

1.2.2? 材料的固定與石蠟切片? 萌發至40 d時，植株株高和基部莖粗的增長趨于平緩。此時參照Jagadish等[18]的方法，由上至下采取CDM及CK的每個節間，浸入FAA固定液[（50%酒精90 mL）+冰醋酸（5 mL）+甲醛（5 mL）]中固定24 h。在LEICA RM2245切片機上將固定好的材料進行切片，切片厚度為10 μm，切片后采取番紅（2.5 g番紅+100 mL 70%酒精）和固綠（1 g固綠+100 mL 95%酒精）對染，封片后使用LEICA DFC295光學顯微鏡觀察和拍照。

1.3? 數據處理

用刻度尺對植株的株高和基部莖粗進行測量，采用Image J軟件對CDM及CK莖切片的橫切面、木質部、韌皮部、表皮和周皮的厚度進行測量，每項指標均重復12組，并計算平均值和標準差，數值以“平均值±標準差”表示，采用u值檢驗法對CDM與CK各項指標進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 株高和基部莖粗分析

CK在發育階段其莖為綠色，CDM則呈現出白色，同一苗齡，CDM相比CK，整體長勢較弱（圖1A～圖1E）。二者的生長發育均呈現出先快速生長（1～15 d）、后緩慢生長（16～40 d）的趨勢。在發育過程中，同一時期CDM的株高均小于CK，且二者之間的差異逐漸增大。發育至10 d時，CDM的株高為12.42 cm，是CK（16.22 cm）的76.57%，差異極顯著（圖1B、圖1F）;發育至40 d時，CDM的株高為20.06 cm，是CK（35.56 cm）的56.41%，差異極顯著（圖1E、圖1F）。可見CDM株高的增長受到嚴重的抑制。同時CDM莖的加粗生長也受到一定的影響。頂芽出土后1～15 d，CDM與CK的基部莖粗尚未出現顯著差異（圖1G）。發育至20 d時，CDM基部莖粗為3.56 mm，是CK（4.28 mm）的83.18%，二者開始出現極顯著差異（圖1C、圖1G）。發育至40 d時，CDM的基部莖粗為3.81 mm，是CK（5.13 mm）的74.27%（圖1E、圖1G），差異極顯著，可見CDM基部莖粗的增長受到明顯的抑制作用。

CDM莖節間1的直徑為1150.76 μm，是CK（2003.93 μm）的57.43%，二者差異極顯著（圖2A、圖2H、圖2W）。此后，在發育的同一時期，CDM莖節間的直徑均小于CK，且二者的增長速度趨于一致，均呈現出先快速生長（節間1～4）再緩慢生長（節間5～10）的趨勢（圖2W）。CDM節間10的直徑為2711.92 μm，是CK（4360.24 μm）的62.20%，差異極顯著（圖2Q、圖2U、圖2W）。二者在相同環境中生長同樣的時間，CDM只發育了10個節間，比CK（12個）少2個，CK直徑在11～12節間迅速生長，CDM則死亡（圖2R、圖2V、圖2W）?？梢奀DM莖的加粗生長受到了抑制。

2.2? 木質部結構分析

CDM初生木質部在1～10節間生長較為平緩;CK初生木質部則在節間4出現一個生長高峰（圖3W）。節間1，CDM初生木質部的厚度為32.03 μm，是CK（46.93 μm）的68.25%，差異極顯著（圖3A、圖3H、圖3W）。可見CDM莖初生木質部的生長受到影響。同時CDM莖次生木質部的生長也受到了抑制。CK在節間3開始出現次生木質部，CDM則在節間4出現，與CK相比較晚（圖3C、圖3K、圖3W）。節間4，CDM的次生木質部的厚度為74.16 μm，是CK（278.21 μm）的26.66%，差異極顯著（圖3D、圖3K、圖3W）。CDM及CK次生木質部的生長發育均呈現先快速生長（節間4～6）后緩慢生長（CDM：節間7～10、CK：節間7～12）的趨勢。發育至節間10時，CDM次生木質部的厚度為313.58 μm，是CK（801.62 μm）的39.12%，差異達極顯著（圖3Q、圖3U、圖3W）。在發育過程中，同一時期CDM初生木質部及次生木質部的厚度均小于CK，尤其在次生木質部生長過程中，二者之間的差異逐漸增大（圖3W），可見CDM莖木質部的發育受到嚴重抑制。

2.3? 韌皮部結構分析

發育至40 d時，CDM節間1初生韌皮部的厚度為38.61 μm，是CK（43.29 μm）的89.19%，二者差異達顯著（圖4A、圖4H、圖4W）;節間3，CDM初生韌皮部的厚度為37.27 μm，是CK（47.95 μm）的77.73%，二者差異極顯著（圖4C、圖4J、圖4W）。每一個對應的節間，CDM初生韌皮部的厚度均小于CK（圖4W）。節間10，CDM初生韌皮部的厚度為33.47 μm，是CK（51.33 μm）的65.21%，差異極顯著（圖4Q、圖4U、圖4W）。可見CDM莖初生韌皮部的發育受到抑制。CK在節間3出現次生韌皮部，CDM則在節間6出現，晚于CK（圖4C、圖4M、圖4W）。節間6，CDM次生韌皮部的厚度為36.32 μm，是CK（70.08 μm）的51.83%，二者差異極顯著（圖4F、圖4M、圖4W）。CDM次生韌皮部厚度呈現先增加后減少的趨勢，CK則一直增加，且每一對應節間，CDM次生韌皮部的厚度均小于CK（圖4W）。節間10，CDM次生韌皮部的厚度為38.79 μm，是CK（98.03 μm）的39.57%，差異極顯著（圖4Q、圖4U、圖4W）;可見CDM莖次生韌皮部的發育同樣受到了抑制。

2.4? 表皮和周皮結構分析

發育至40 d時，CDM節間1的表皮厚度為12.23 μm，是CK（9.47 μm）的129.14%，二者差異極顯著（圖5A、圖5H、圖5W）;節間1～7，每一個對應的節間，CDM表皮的厚度均大于CK（圖5W）。節間10，CDM的表皮厚度為7.12 μm，是CK（6.06 μm）的117.49%，二者差異極顯著。CDM在節間8出現周皮，晚于CK節間5（圖5S、圖5E、圖5W）。出現周皮后，二者的表皮均退化，厚度逐漸減小（圖5W）。CDM與CK的周皮長勢相同，呈逐漸增加的趨勢（圖5W）。節間8，CDM周皮厚度為31.58 μm，是CK（32.23 μm）的97.98%，二者無顯著性差異（圖5O、圖5S、圖5W）。節間10，CDM周皮的厚度為35.80 μm，是CK（38.93 μm）的91.96%，差異顯著（圖5Q、圖5U、圖5W）?？梢奀DM莖周皮出現的時間被延遲。

2.5? 莖中次生結構起始節間比較

由表1可知，CK幼苗莖中有25%的次生木質部在第2個節間出現，75%在第3節間出現;次生韌皮部有75%在第3節間出現，25%在第4節間出現。CDM幼苗莖中約33%的次生木質部在第3節間出現，約67%在第4節間出現，次生韌皮部約33%在第4節間出現，67%在第6節間出現。計算可知，CDM與CK莖中出現次生韌皮部的節間之差大于次生木質部，說明相對于次生木質部，CDM次生韌皮部的起始受到的抑制作用更大。

CK幼苗莖中有75%的周皮在第5節間出現，25%在第6節間出現。CDM幼苗莖中各有約33%的周皮分別在第6節間、第8節間和第9節間出現。CDM與CK莖中出現周皮的節間之差大于次生韌皮部。

3? 討論

莖的加粗生長包括木質部和韌皮部的加粗生長，二者的次生生長在整個加粗生長的過程中起著重要作用。本研究中CDM的莖比CK細弱，其主要原因是CDM莖中次生木質部和次生韌皮部的發育受到了抑制。謝柳青等[17]發現，在生長40 d的CDM次生生長莖中下調的基因在氨基酸的生物合成、碳代謝、氧化磷酸化等途徑中顯著富集;同時其上調基因主要富集在半乳糖代謝、碳水化合物代謝、脂質代謝等過程，表明此時CDM次生生長莖中基礎代謝受到影響。此外，CDM莖中初生木質部、初生韌皮部的發育也受抑制。有研究表明，蔗糖可以刺激韌皮部細胞的分裂和分化[19]。在鄭李婷等[16]對菠蘿蜜嫩莖的轉錄組進行分析后發現，CDM嫩莖中糖代謝途徑的基因下調表達?？梢姡芰抗霈F異?？赡苁菍е虑o初生生長和次生生長受到抑制的原因之一。

相比于次生木質部，CDM莖中次生韌皮部受到的抑制作用更為明顯。莖中次生木質部將水分和礦質營養從下向上運輸到植物體的形態學上端，次生韌皮部則將葉片中的光合產物從上至下運輸到根部[20]。光合作用的核心色素葉綠素在植物的綠色組織中均有分布，其中在葉中的含量最多[21]。因此和根部相比，葉綠素缺失導致光合產物的減少對CDM葉片中有機物合成的影響更大。葉片中有機物含量減少，對于韌皮部的卸載功能要求降低。因此，CDM莖中次生韌皮部形成受到的抑制作用更大可能是對上述過程的一種響應，但其分子機理目前尚不明確。

本研究從結構方面報道了菠蘿蜜CDM與CK在株高、基部莖粗、木質部、韌皮部、表皮和周皮上的差異，然而影響CDM莖發育的分子機制還需要進一步研究，本研究為木本植物莖發育的研究提供新的思路。

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