我國木薯花葉病毒病的發生危害及其病原鑒定

王國芬 李超萍 時濤 周司珊 李博勛 蔡吉苗 林兆威 黃貴修

摘? 要：為明確國內木薯花葉病毒?。╟assava mosaic virus disease）的危害情況、田間癥狀及其病原類型，本研究于2018—2019年調查了該病在國內的分布情況、癥狀特征及種質來源等數據，采集了8?。▍^）19地的384份樣品，利用特異性引物檢測2種木薯花葉病毒侵染引起的癥狀類型，并通過序列比對明確其病原特點。結果表明：木薯花葉病毒病已經在我國發生，種莖調運是該病遠距離傳播的主要原因;國內木薯花葉病毒病病原有斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）和木薯普通花葉病毒（Cassava common mosaic virus， CsCMV）2種病毒，可分為單獨感染、復合感染，其中SLCMV的檢出率為21.1%，CsCMV的檢出率為36.5%，SLCMV-CsCMV復合侵染率為15.1%;檢測到的SLVMV與東南亞SLCMV序列同源性為99.4%～99.7%，檢測到的CsCMV與拉丁美洲的CsCMV序列相似性為91%～96%。推測國內木薯花葉病毒病主要由2種病毒侵染引起，且普通花葉病毒有產生序列變異的可能性。

關鍵詞：木薯;斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）;木薯普通花葉病毒（CsCMV）;檢測;復合侵染

中圖分類號：S435.33????? 文獻標識碼：A

Distribution and Pathogen Detection of Cassava Mosaic Virus Disease in China

WANG Guofen1， LI Chaoping1， SHI Tao1， ZHOU Sishan2， LI Boxun1， CAI Jimiao1， LIN Zhaowei1，

HUANG Guixiu1

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， China / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： To clarify the disease situation， symptom types and pathogens of cassava mosaic virus disease in China， 19 locations in 8 provinces were investigated in 2018-2019， and 384 narcissus samples were collected. Data analysis results showed that cassava mosaic virus disease had already occurred in China Stem transportation was the main reason for the long-distance transmission of the disease. Specific primers of Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV） and Cassava common mosaic virus （CsCMV） were used to detect the 384 samples. The results showed that SLCMV and CsCMV were detected in 21.1% and 36.5% samples， respectively. 15.1% samples were mix-infected by the two viruses. The sequence similarity between the detected SLVMV and Southeast Asian SLCMV was 99.4%-99.7%， and the sequence similarity between CsCMV and Latin America was 91%-96%. It indicates that domestic cassava mosaic disease is mainly caused by these two viruses， and the Common mosaic virus may have some sequence mutation.

Keywords： Manihot esculenta; Sri Lankan cassava mosaic virus （SLCMV）; Cassava common mosaic virus （CsCMV）; detection; mixed infection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.023

木薯（Manihot esculenta）為大戟科多年生作物，主要種植在熱帶亞熱帶國家和地區，是世界上第六大糧食作物，在我國華南及中部多個?。▍^）都有種植，相關產業在農業經濟中占有重要地位。木薯花葉病毒病對木薯產業具有毀滅性危害，全球范圍內每年因花葉病影響可造成2500萬t木薯產量損失，影響到5億多人口的糧食安全[1]。20世紀90年代，木薯花葉病毒病在烏干達大爆發，許多地區的種植戶被迫放棄種植木薯[2]。Thresh等[3]估算非洲地區花葉病發生后，田間病株平均產量約損失30%～40%，產量損失最高達86%。2015年，由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系引起的花葉病在柬埔寨東部和越南南部交界地區發生并迅速向周邊地區蔓延[4]，2018年6月，相繼在柬埔寨、越南和泰國的多個省都發現了該病的危害[5]。3 a內，病害從柬埔寨東部桔井省和上丁省的單個種植園，發展到了覆蓋該地區及其周邊10%的種植地。受病害影響，柬埔寨2017年鮮薯價格比2016年漲了2～3倍，但單產從2016年的18 t/hm2，減至2017年的15 t/hm2[6]。我國已將非洲木薯花葉病毒列入進境植物檢疫性有害生物名錄[7]，2018年8月，木薯花葉病毒病在我國海南、福建發現并報道[8-9]。該病傳播速度快，對木薯產業危害嚴重，病害在國內的發生，立即引起了國內木薯主產區薯農及科研人員的高度重視。

世界范圍內，木薯的重要病毒病主要有3個類群：第一種為雙生病毒引起的木薯雙生病毒花葉?。╟assava mosaic disease， CMD），病原為聯體病毒科（Geminivieidae），菜豆金黃色花葉病毒（Begomovirus）;第二種為甘薯病毒引起的木薯褐條?。╟assava brown streak disease， CBSD），病原為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），甘薯病毒（Ipomovirus）;第三種為馬鈴薯X病毒引起的木薯普通花葉?。╟assava common mosaic disease， CsCMD），病原為馬鈴薯X病毒組（Potexvirus），馬鈴薯X病毒（Potato virus X）。在東南亞及國內發現的重大危險性入侵木薯花葉病毒病，主要為第一種類型，由雙生病毒引起的木薯花葉病毒病，強致病株系為斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）;木薯褐條病目前僅在非洲中東部地區危害[10];多年來，木薯普通花葉病毒病（CsCMD）僅在拉丁美洲發現，我國臺灣于1981年有過報道[11]。

為進一步明確引起國內木薯花葉病毒病的病毒種類及其危害情況，2018—2019年，本團隊研究人員集中對國內木薯主栽區的木薯花葉病毒病疫情進行調查，并對病毒株系進行鑒定，為明確國內花葉病種類，提高木薯病毒病的監測預警，避免罹病種莖的調運，保證木薯的健康生產提供必要的檢測技術。

1? 材料與方法

1.1? 田間調查和樣品采集

參考《外來入侵物種普查及其安全性考察技術方案》中的病害田間調查方法，于2018年8月至2019年8月，分別對我國海南、廣東、廣西、福建、江西、湖南、貴州和云南8省（區）的19個木薯品種或種質保存基地進行調查，同時對廣西2地農戶自行種植地進行考察。實地監測木薯葉片是否黃化、花葉、皺縮、褪綠，大小是否有變化，植株是否矮化等;對各地木薯花葉病突發原因進行調查，走訪種莖來源，調查病害發生時間和對可能傳入的途徑進行分析。

采集樣品384份，分批整理后保存于–80 ℃冰箱中備用，陽性對照為帶有目標病毒核酸序列的質粒，健康對照為防蟲溫室培育的健康木薯葉片。

1.2? 改良CTAB一步法制備核酸

所有的試劑、槍頭及EP管均需RNAase處理。取50～100 mg幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末，加入65 ℃預熱的CTAB-巰基乙醇緩沖液600 μL（2% CTAB，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris- HCl 8.0，1.4 mol/L NaCl，1% PVP40，使用前加入20%β-巰基乙醇），充分震蕩混勻;65 ℃水浴鍋中恒溫水浴30～60 min;12 000 r/min離心5 min，上清液經2次600 μL氯仿萃取后，加入等體積預冷異丙醇，于4 ℃冰箱沉淀核酸30 min;離心，用1 mL預冷70%乙醇清洗2次，干燥后的核酸用無RNAase的ddH2O充分溶解，進行電泳及濃度檢測后分裝，一部分直接用于PCR，另一部分進行反轉錄，用獲得的cDNA進行PCR擴增。DNA及cDNA于–20 ℃冰箱中保存備用。

1.3? 引物設計與合成

煙粉虱傳雙生病毒簡并引物PA/PB[12]，擴增雙生病毒共同區及外殼蛋白保守區域，目的片段約500 bp，用于粉虱傳雙生病毒引起的木薯花葉病病原檢測。參考文獻[8]合成斯里蘭卡木薯花葉病毒DNA-A特異引物AF/AR，并通過合成背靠背引物擴增DNA-A全長序列，合成斯里蘭卡木薯花葉病毒DNA-B特異引物BF/BR，擴增雙生病毒DNA-B組份;參考文獻[13]合成普通木薯普通花葉病毒特異引物CsCMV-3269-F/CsCMV- 3896-R，各引物序列見表1。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1.4? 病毒檢測

1.4.1? SLCMV檢測? 先通過雙生病毒的通用簡并引物PA/PB對檢測樣品DNA進行PCR擴增，然后用SLCMV DNA-A特異性引物AF/AR和SLCMV DNA-B鏈特異引物BF/BR進行驗證。

1.4.2? CsCMV檢測? 按照cDNA試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存，用RNA病毒特異性引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R進行PCR檢測。PCR擴增條件及PCR體系均參考文獻[8， 12-13]的方法進行。

1.5? 序列分析

以上PCR產物用1.0%瓊脂糖（1.0×TAE）電泳檢測，BioRad凝膠成像儀觀察，記錄結果。選擇代表性樣品進行測序，根據序列比對的結果進行分析。序列的編輯和分析借助DNAMAN 8、DNAStarLasergene 7.1和MEGA 7.0等3個軟件完成。

2? 結果與分析

2.1? 國內木薯花葉病的分布情況

目前國內已審定的木薯品種共36個，各地保存的木薯材料多為各屬地保存、引進或者通過多種途徑創制的種質材料，尚未進行審定，以統一的字母或者編號區分種質來源，一般情況下各地種植的種質數量遠大于品種數量。本研究調查統計了各種植區（地）出現花葉癥狀的木薯品種（種質）（表2），從數量上看，2018年和2019年的品種（種質）發病率分別為5.2%和9.4%，廣西貴港、北海和海南白沙2018年尚未發現感病植株，2019年由于種植了從發病區調運的種莖，導致病害發生;品種（種質）上看，主栽品種出現了花葉癥狀植株，2018年調查的7省13地，感病的主栽品種有‘華南9號和‘南植199，其他新種質如P系列、‘27-4和‘39-2等;2019年調查的8省19地，顯癥植株包括2018年的所有已知品種和新引進食用品種TCGRI系列。調查中，農戶的種植地（表中編號20和編號21）均無木薯花葉病毒病顯癥植株，木薯花葉病毒病還僅發生于調查所涉及到的品種（種質）保存基地。

2.2? 國內木薯花葉病的癥狀類型

田間調查發現，出現花葉病癥狀的木薯植株，可分為3種癥狀類型：第一種表現為葉片皺縮畸形，植株矮化，感病植株首先在葉片上出現褪綠的小斑點，隨后逐漸擴大并與正常綠色形成典型花葉狀，受侵染葉片背面有時可見突起，葉片普遍變小，葉片中部和基部常收縮成蕨葉狀（圖1A）;第二種表現為葉片花葉變形，植株矮化，感病植株首先在嫩葉上出現典型花葉，逐漸在老葉及整株葉片上形成花葉癥狀（圖1B）;第三種表現為植株嫩葉褪綠、花葉癥狀，葉片以褪綠的小斑點向外蔓延，邊界不清晰，大部分僅在上層葉片表現癥狀，不影響植株生長（圖1C）。

在氣溫較低的冷涼地區，第一、第二種癥狀的植株呈現典型花葉或畸形癥狀后，長勢嚴重削弱，葉片皺縮且不能正常展開，植株常矮化，不能正常結薯，嚴重時整株枯萎死亡。海南、廣西等地區，春季和秋末季節氣溫較低，植株的“花葉”癥狀明顯，夏天封行以后，葉片上的花葉癥狀減弱，可能是由于高溫天氣不利于癥狀的形成，生長中后期由于氣溫下降，受侵染植株癥狀會再度呈現。

2.3? 木薯花葉病毒的檢測及其感染情況

將3種花葉癥狀類型的木薯葉片分別進行總核酸提取，用SLCMV和CsCMV特異引物進行PCR及RT-PCR擴增，以含有病毒序列的載體作為陽性對照。結果表明，與Wang等[8]的結果一致，雙生病毒的通用引物PA/PB對木薯花葉病毒無有效的擴增條帶。第一種癥狀類型樣品僅能擴增到SLCMV的特異條帶，引物AF/AR-PCR產物大小0.7 kb（圖2A），無CsCMV的擴增片段，表明該癥狀類型由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系單獨感染引起;第二種癥狀類型，表現出葉片花葉和植株矮化的樣品不僅能擴增到SLCMV的特異性條帶，也能擴增到CsCMV的特異片段，表明該種癥狀類型由斯里蘭卡木薯花葉病毒和木薯普通花葉病毒2個株系復合感染引起;第三種癥狀類型（圖2B），僅出現葉片花葉褪綠癥狀的植株樣品，無SLCMV擴增產物，只能擴增到CsCMV的特異性片段，引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-R產物大小0.6 kb，表明該類型由木薯普通花葉病毒株系侵染形成。與斯里蘭卡木薯花葉病毒侵染形成的典型花葉癥狀相比，普通木薯花葉病毒株系病葉上“正常綠色”部分和“變色或黃化”部位之間界限不清晰，葉片無皺縮變形。

在2018年和2019年的384份測試樣品中，斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（SLCMV）單獨侵染的檢出率為21.1%，分別來自海南、廣東、云南、廣西、貴州和福建6個省（區）的樣品;木薯普通花葉病毒（CsCMV）單獨侵染的檢出率為78.8%，包括所有8個?。▍^）的樣品;SLCMV-CsCMV復合侵染率為33.0%，主要來自海南、廣西、廣東和貴州4個?。▍^）的樣品。由表3所示，CsCMV的檢測僅隨機選取了其中的179個樣品，其感染率為78.8%，其中2019年每個采樣點均只隨機選取了3個樣品進行檢測，只有1個為陰性，其余樣品均為陽性，據此推測若是將所有的樣品進行檢測，CsCMV的感染應該是普遍存在的。

2.4? 木薯花葉病毒的鑒定

選取2019年海南儋州（DG1922）和貴州望謨（GZ1924）2個斯里蘭卡木薯病毒陽性檢測樣品，經測序獲得DNA-A和DNA-B全基因組序列，在Genbank的登錄號為MN688214-MN688217。經BLAST比對表明，DG1922和GZ1924的DNA-A序列與已經報道的斯里蘭卡木薯病毒株系柬埔寨分離物SLCMV-Cambodia（KT861468）[4]、越南分離物SLCMV-VTN6（LC312131）[14]、泰國分離物SLCMV-Surin1（MN544647）和中國分離物SLCMV-HN7（MH891840）[8]的序列同源性都在99%以上。為進一步明確國內木薯花葉病毒的歸類，從Genbank下載11個木薯花葉病毒株系共37個不同分離物的DNA-A序列，與DG1922和GZ1924的DNA-A序列進行聚類分析，以番茄斑駁病毒序列（L14460）為樹根，應用MEGA 7.0-ClastalW聚類，構建NJ（Neighbor-Joining）樹。結果如圖3所示，37個分離物均可嚴格地聚到各自所屬的不同株系分枝中，DG1922和GZ1924序列均與斯里蘭卡木薯花葉病毒株系聚在同一分枝，進一步表明，引起國內木薯花葉病毒病的雙生病毒主要為斯里蘭卡木薯花葉病毒株系。

同樣，選擇3個地點共5個木薯普通花葉病毒陽性檢測樣品分離物海南儋州（NX23，NX28）、廣東開平（GD）和江西東鄉（JX1，JX3）目的條帶進行測序，經BLAST比對顯示，目標序列與已經報道的拉丁美洲多個木薯普通花葉病毒分離物CsCMV-Arg104（KT002434）、CsCMV-Bra456（KT002429）和CsCMV-Arg128（KT002427）的依賴于RNA的RNA多聚酶基因（RdRp）序列同源性在91%～96%之間。引起木薯普通花葉病毒病的馬鈴薯X病毒組（Potexvirus）有5個株系，主要分布在阿根廷、巴西和哥倫比亞[15]，分別下載這些株系的24個拉丁美洲木薯普通花葉病毒分離物RdRp基因序列，以非洲花葉病毒株系為樹根，聚類分析表明，國內木薯普通花葉病毒株系與已經報道的多個株系序列相似性較遠，自為一個分枝，而且各個序列之間也有差異（圖4）。表明國內的普通花葉病毒株系產生了較大的變異，形成獨立分枝，有進化出新株系的可能性。

3? 討論

自從2016年在國內首次發現木薯花葉病毒?。ū狙芯渴覂炔抠Y料）和2018年正式報道以來[4， 9]，陸續在國內多個木薯種植地發現該病害。本研究通過對國內多地木薯花葉病毒病的田間調查、癥狀分析和病原鑒定，表明國內已發生木薯花葉病毒病，但范圍還僅限于品種（種質）保存基地，尚未傳播到生產一線。由雙生病毒引起的木薯花葉病的傳毒媒介為煙粉虱，主要引起木薯花葉病毒病短距離的傳播危害，遠距離傳播主要通過罹病種莖和帶毒薯類產品的調運和農產品交易等[1]，本研究團隊于2016年首次發現木薯花葉病毒病為害的品種‘東莞紅尾，是種植了從引種隔離圃中調運出來的種莖;2017年在海南文昌發現的2個出現癥狀的品種‘SC10和‘SC205，是由于前期種植了從東南亞引進的感病種質，導致部分植株被感染;而在本研究中的調查發現，2018年和2019年各地出現癥狀的種質，幾乎都來源于調運的種莖，而當地的主栽品種，由于缺乏抗性，部分品種也出現了感病情況。這些數據表明，種植引進和調運的罹病種莖是2018年、2019年各?。▍^）出現病害的主要原因。2015年時濤等[16]通過有害生物風險性分析（PRA）程序評估木薯花葉病毒病在國內的綜合風險值R為2.42，屬于高度危險的病害，而且國內的大部分主栽品種均不具備對該病的抗性[17-19]。綜上所述，加強病害監測，禁止從疫區調運種莖，是預防病害傳播、保障木薯產業健康發展的重要舉措。

本研究通過對國內多地木薯花葉病癥狀和病原的鑒定調查，發現目前引起國內木薯產生花葉癥狀的有3種情況，即由SLCMV單獨感染引起的木薯斯里蘭卡花葉病毒病、SLCMV和CsCMV共同侵染引起的復合感染以及由CsCMV單獨侵染引起的木薯普通花葉病毒病。從采集樣品檢測的結果來看，海南、廣東、云南、廣西、貴州和福建6個?。▍^）都有斯里蘭卡木薯花葉病毒和普通花葉病毒的感染，而江西和湖南則以木薯普通花葉病毒感染為主。

研究人員根據雙生病毒結構和序列的差異及其主要發生的地區，將木薯花葉病毒（CMV）分為11個株系和1個重組株系：即非洲木薯花葉病毒株系（African cassava mosaic virus， ACMV），木薯花葉病毒馬達加斯加株系（cassava mosaic Madagascar virus， CMMGV），東非木薯花葉病毒株系（East African cassava mosaic virus， EACMV），東非木薯花葉病毒烏干達變種（East African cassava mosaic-Ugandan variant， EACMV-

UG），東非木薯花葉病毒喀麥隆株系（East African cassava mosaic Cameroon virus， EACMCV），東非木薯花葉病毒肯尼亞株系（East African cassava mosaic Kenya virus， EACMKV），東非木薯花葉病毒馬拉維株系（East African cassava mosaic Malawi virus， EACMMV），東非木薯花葉病毒桑給巴爾株系（East African cassava mosaic Zanzibar virus， EACMZV），南非木薯花葉病毒株系（South African cassava mosaic virus， SACMV），非洲木薯花葉布基納法索病毒（African cassava mosaic Burkina Faso virus， ACMBFV），印度木薯花葉病毒株系（Indian cassava mosaic virus， ICMV）和斯里蘭卡木薯花葉病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus， SLCMV）[20]。引起木薯普通花葉病的馬鈴薯X病毒組（Potexvirus）的5個株系則主要危害南美洲地區阿根廷、巴西和哥倫比亞的木薯。由于病毒結構簡單，而且需要適應環境和品種的更替，常與寄主和其他病毒產生重組，從而變異成不同的株系。非洲強致病力的重組株系時有報道，目前在烏干達和加納地區的強致病力病毒株系EACMV-UG，為東非木薯花葉病毒株系和非洲花葉病毒株系的重組體[21]。木薯普通花葉病毒病主要發生在拉丁美洲地區，尚未在非洲和東南亞發現，盡管多數文獻報道南美洲的木薯普通花葉病毒對木薯的產量影響較小，但Venturini等[22]研究表明，巴西CsCMV的發生導致木薯品種‘BRS Kiriris和‘BRS Jari的產量損失達30%～60%。目前國內外均未見雙生病毒和普通花葉病毒共同侵染木薯的報道，本研究檢測到國內多地木薯同時攜帶2種病毒的情況屬首次報道。

國內木薯花葉病毒病由斯里蘭卡木薯花葉病毒株系引起，與2015年來影響柬埔寨、越南和泰國木薯產業的病毒株系有非常高的序列相似性，表明目前國內的木薯病毒與東南亞的株系有著很高的同源性，也可能直接或者間接來源于薯類農產品的邊境或者國際貿易。木薯普通花葉病毒引起的花葉癥狀不典型，不具備扭曲畸形的特征，田間觀察容易被忽視。聚類分析顯示國內的CsCMV與南美洲多個株系序列相似性在96%以下，推測木薯普通花葉病毒株系已長期侵染國內多個木薯品種，存在序列重組變異的可能，須通過全基因組序列測定及變異率分析進行證明。國內的木薯產業及其育種在“一帶一路”和國際合作的帶動下，早期從哥倫比亞的國際熱帶農業研究中心（CIAT）引進了一些國外的優良種質[23]，也為病害的引入和傳播提供了可能，但目前國內尚無因該病害而導致木薯產量和品質下降的報道，也是該病害沒有得到足夠重視的重要原因之一。

基于實際應用的需要，木薯病毒的檢測技術在近年得到了快速發展。2019年Boykin等[24]通過結合PDQeX DNA純化技術與MinION和MinIT移動測序設備，建立了便攜式的林間試驗室（Tree Lab）系統，用于對非洲木薯花葉病毒的現場早期診斷，突破了傳統鑒定方法對大型設備的需求以及數據聯網分析等程序，為技術人員在田間對病害的準確診斷提供了可能。Minato等[5]采用PCR技術對柬埔寨和越南的6480個木薯花葉病毒病疑似樣品進行檢測，結果表明樣品感染率為7.6%，且發現14%的陽性樣品無木薯花葉病毒病的典型癥狀。2015年Otti等[25]應用高通量多重實時PCR技術，可同時有效檢測非洲的2種木薯重要病毒，即花葉病毒（ACMV）和褐條病毒（UCBSV），也分同屬于DNA病毒和RNA病毒;Uke等[26]通過PCR和圖像識別技術檢測到引起印度木薯花葉的2種病毒印度木薯花葉病毒（ICMV）和斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV），但無法對2種病毒進行有效區分。除了雙生病毒引起的花葉病，國際上還有木薯褐條病、蛙皮病和多種潛在病毒性病害，由于國內首次發現該病的感染，其檢測的方向多為雙生病毒，除了存在普通花葉病毒的復合感染之外，是否還存在其他病毒的侵染，需要配合更多的檢測技術進行深入分析。而作為分子生物學技術檢測的基礎，高效率的核酸抽提，以及微量病毒的有效提純最為關鍵，很多假陰性的結果都與病毒核酸的抽提效率相關，同時作為最為便利的樣品來源，以葉片作為靶標樣品是否最有效也需要作進一步驗證[27]。

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責任編輯：謝龍蓮