5個抗病基因功能標記在234份番茄材料中的檢測

陳莉菁 劉子記 謝尚潛 凌鵬 朱婕

摘? 要：番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，病害的發生和蔓延使番茄生產受到嚴重影響，培育多抗番茄品種是防治病害最為經濟和有效的方法。本研究利用功能標記對234份番茄材料進行Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a等5個抗病基因的檢測，發現其中含Cf-9的番茄材料為136份，含Mi-1的材料為20份，含I-2的材料為124份，含Ph-3的材料38份，含Tm-2a的材料為24份。234份番茄材料中，不含這5個抗病基因的材料有29份;含1個抗病基因的材料有106份;含2個抗病基因的材料有70份;含3個抗病基因的材料有23份;含4個抗病基因的材料有6份，分別為11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;同時含這5個抗性基因的番茄材料尚未檢測到。該研究結果將為進一步開展多個抗病基因的聚合育種提供參考依據。

關鍵詞：番茄;功能標記;抗病基因;聚合育種

中圖分類號：S641.2????? 文獻標識碼：A

Detection of Five Disease Resistance Genes in 234 Tomato Materials with Functional Markers

CHEN Lijing1，2， LIU Ziji3， XIE Shangqian2， LING Peng2， ZHU Jie1，2

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Tomato is one of the most important vegetable crops in the world. Tomato production is seriously affected by the occurrence and spread of diseases. It is the most economical and effective way to control diseases by cultivating varieties with multiple resistant genes to different diseases. Functional markers were used to test the appearance of Cf-9， Mi-1， I-2， Ph-3 and Tm-2a genes in 234 tomato materials. Cf-9 was found in 136 materials. Mi-1 was found in 20 materials. I-2 was found in 124 materials. Ph-3 was found in 38 materials. And Tm-2a was found in 24 materials. Among the 234 tomato materials， 29 did not contain any of these five resistant genes， 106 contained one resistant gene， 70 contained two resistant genes， 23 contained three resistant genes， 6 contained four resistant genes （line 11CT387-2M， 11CHT164-2， 11CT150， 11CT271， 11CT730 and 11CT774）. None of the materials had five resistant genes. The results would lay a foundation for resistance genes pyramiding in the future.

Keywords： tomato; functional marker; resistance gene; multiple genes pyramiding

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.025

番茄（Solanum lycopersicum L.）色彩鮮艷，營養豐富，既可作為蔬菜，又可作為水果食用，且加工潛力較大，是世界上經濟效益最高、栽培最廣泛的園藝作物之一。番茄是典型的設施栽培作物，極易受到設施的特殊環境、連作障礙及病害的影響。迄今為止已發現的番茄病害達200多種，其中較嚴重的病害包括40余種，極大影響了番茄的產量和質量[1]。因此，選育抗病性強的番茄品種顯得尤為關鍵。迄今為止，在番茄中定位并克隆了一批抗病基因，包括番茄煙草花葉病毒病、葉霉病、晚疫病、枯萎病和根結線蟲病抗性基因等。

番茄葉霉病由半知菌（Cladosporium fulvum）引起。目前發現的葉霉病抗性基因至少有24個（Cf-1至Cf-24）。通過Ac-Ds轉座子標簽法克隆了Cf-4和Cf-9基因[2-3]，后又通過圖位克隆法獲得了Cf-2和Cf-5基因序列[4-5]。比較分析發現，已克隆的這幾個Cf基因均屬于LRR-TM類型，不同Cf基因亮氨酸重復數目不同，決定了對葉霉病菌不同生理小種的識別[6]。Cf基因屬于多基因家族，已克隆的Cf-4/Cf-9、Cf-2/Cf-5分別集中于番茄1號和6號染色體上，形成2個復合基因座[3， 7]。截至目前，Cf-9是利用最為廣泛的抗葉霉病基因。

根結線蟲對茄科作物的危害尤為嚴重。番茄中已定位了9個抗根結線蟲基因（Mi-1至Mi-9）。Mi-1是目前在番茄中唯一被克隆的抗根結線蟲基因。Mi-1位點含有同源基因Mi-1.1和Mi-1.2，其中Mi-1.1并不具有抗性，而Mi-1.2才是真正的根結線蟲抗性基因。Mi-1.2基因編碼一條含1257個氨基酸的多肽，屬于LZ-NBS-LRR類型抗性基因[8]。

番茄枯萎病由番茄尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起，致病生理小種有1號、2號和3號3種[9]。常用的番茄枯萎病抗病基因有I-1、I-2和I-3，其中I-2能兼抗1號和2號小種，具有較大的應用價值。Simons等[10]利用圖位克隆法分離I-2基因，發現該基因編碼一條含1266個氨基酸的多肽，屬于NBS-LRR類型抗性基因。

目前已被鑒定的番茄晚疫病抗性基因包括Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4和Ph-5。其中Ph-3是一個部分顯性基因，對晚疫病菌的多個生理小種都具有抗性[11]。Ph-3基因已經被轉育到優良的栽培種中，并在生產實踐中表現出較好的抗性[12]。張春芝[11]利用圖位克隆法分離了Ph-3基因，發現該基因編碼一條851個氨基酸的多肽，屬于CC-NBS-LRR類型抗性基因。

番茄花葉病毒病抗性主要由Tm-1、Tm-2和Tm-2a（Tm-22）等基因位點控制，其中以Tm-2a抗性最為持久[13]。Lanfermeijer等[14]利用轉座子標簽法解析Tm-2a位點，發現該位點的抗病性由單基因控制，Tm-2a基因編碼一條含861個氨基酸的多肽，屬于CC-NBS-LRR類型抗性基因。

在抗病品種的培育過程中，利用傳統方法育種周期較長，且具有較大的盲目性。利用分子標記技術輔助育種，可以在苗期進行大量的抗病性鑒定，不受時間地域限制，能顯著加速育種進程[15]。功能分子標記即基因特異性標記，是基于目標基因本身的核苷酸序列在不同個體間的差異而開發的分子標記。相比于其他類型的分子標記，功能標記最大的優點是與目標基因共分離，故與目標基因的表現型高度一致，是一種非常理想的分子標記類型。

本研究將利用番茄Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a這5個抗病基因的功能分子標記對234份番茄育種材料進行檢測，明確不同材料含有的抗病基因情況。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究檢測的234份番茄材料中，1～37號為市售商業品種，38～234號為中國熱帶農業科學院提供的育種材料（表1）。將番茄材料盆栽于海南大學農科樓溫室，用于基因組DNA提取及抗病基因檢測。

1.2? 方法

1.2.1? 番茄總DNA提取? 番茄種子浸種12 h后播種，25 ℃下培育30 d，待長出3～4片子葉，采用CTAB法提取總DNA[16]，?20 ℃保存。

1.2.2? 番茄抗性基因功能標記的PCR反應體系利用番茄抗葉霉病基因Cf-9、抗根結線蟲基因Mi-1、抗枯萎病基因I-2、抗晚疫病基因Ph-3和抗煙草花葉病毒病基因Tm-2a這5個抗病基因的功能標記開展鑒定工作，標記具體信息見表2。5個番茄抗性基因功能標記采用相同的PCR反應體系和程序。25 μL PCR反應體系為：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，8 μmol/L正反向引物各2 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL和Taq DNA聚合酶1.25 U，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min，合適溫度退火1 min，72 ℃延伸80 s， 32個循環;72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。其中需要用限制性內切酶TaqⅠ對根結線蟲抗性基因Mi-1的PCR產物進行酶切，20 μL酶切體系包括1×TaqⅠ Buffer，5U TaqⅠ內切酶和15 μL PCR反應產物，65 ℃酶切12 h。

2? 結果與分析

2.1? 葉霉病抗性基因Cf-9檢測

Cf-9功能標記為顯性標記，含有Cf-9基因的番茄材料可擴增出415 bp的條帶，不含Cf-9基因的番茄材料則無擴增產物（圖1）。經檢測顯示，234份番茄材料中，含Cf-9抗性基因的材料有136份，其余98份不含該基因。

2.2? 根結線蟲抗性基因Mi-1檢測

Mi-1功能標記為共顯性標記，所有番茄材料均能擴增出750 bp特異性條帶，經TaqⅠ酶切后，出現3種帶型（圖2）。第1種帶型含有570 bp和180 bp條帶，代表純合的Mi-1抗性位點;第2種帶型僅包含750 bp的條帶，無法被酶切，代表該材料不含Mi-1抗性基因;第3種帶型包括750、570、180 bp 3種條帶，代表雜合的Mi-1抗性位點。經檢測顯示，234份番茄材料中，含Mi-1純合抗性位點的材料有9份，含雜合抗性位點的材料有11份，不含該抗性基因的材料有214份。

2.3? 枯萎病抗性基因I-2檢測

I-2功能標記為共顯性標記，可擴增出3種帶型（圖3）。第1種帶型含有1條590 bp條帶，代表純合的I-2抗性位點;第2種帶型含有2條640 bp條帶，代表不含I-2抗性基因;第3種帶型含有590 bp和640 bp 2個條帶，代表雜合的I-2抗性位點。經檢測顯示，234份番茄材料中，含I-2純合抗性位點的材料有66份，含雜合抗性位點的材料有58份，不含該抗性基因的材料有110份。

2.4? 晚疫病抗性基因Ph-3檢測

Ph-3功能標記為共顯性標記，可擴增出3種帶型（圖4）。第1種帶型只含有1條376 bp條帶，代表純合的Ph-3抗性基因;第2種帶型則含有1條682 bp條帶，代表不含Ph-3抗性基因;第3種帶型含有376和682 bp 2個條帶，代表雜合的Ph-3抗性位點。經檢測顯示，234份番茄材料中，含Ph-3純合抗性位點的材料有7份，含雜合抗性位點的材料有31份，不含該抗性基因的材料有196份。

2.5? 煙草花葉病毒病抗性基因Tm-2a檢測

Tm-2a功能標記為顯性標記，可擴增出2種帶型（圖5）。含Tm-2a抗性基因的材料可擴增出1條472 bp的條帶;不含該抗性基因則無擴增產物。經檢測顯示，234份番茄材料中，含Tm-2a抗性基因的材料有24份，其余210份材料不含該基因。

2.6? 5個番茄抗性基因功能標記檢測結果

本研究檢測的234份不同類型番茄材料中，完全不含5個抗性基因的材料有29份，只含1個抗性基因的材料有106份，同時含2個抗性基因的材料有70份，含3個抗性基因的材料有24份，含4個抗性基因的材料有6份，分別為11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;尚未檢測到同時含這5個抗性基因的番茄材料（表3）。

3? 討論

番茄是全世界大宗的蔬菜作物之一，連作和設施栽培等因素加劇了病害的蔓延。聚合多個抗病基因是番茄抗病育種的重要手段。蘇曉梅[21]利用Mi-1和Ty-1功能標記檢測83份番茄材料，發現其中24份材料同時含有這2個抗病基因。暴會會等[22]對32份番茄材料進行7個抗病基因的檢測，發現只有9份材料含有2個抗病基因，未檢測到含有3個以上抗病基因的材料。可見抗病基因聚合的效率并不太高。本研究中，僅42%番茄材料檢測出了含2種以上的抗病基因，其中聚合3～4個抗病基因的材料僅占12%，未檢測到聚合5個抗病基因的材料。由此可見，仍需加大抗病基因聚合的力度，為培育多抗番茄品種奠定基礎。本研究使用的37個商業品種中，聚合3個抗病基因的材料占43%，說明番茄商業化育種進程中，抗病基因聚合的力度正在加大，多抗育種受到了越來越高的重視。

本研究使用的234份番茄材料，從果形上看，大果類型為119份，小果類型為115份，數量相近，約各占1/2。在這2種果實類型中均以檢測到1～2個抗病基因為主，且大果類型中完全不含這5個抗病基因的材料略多于小果類型。從果色上看，有紅色134份、粉色36份、黃色50份、綠色5份、黑色6份、紫色3份，不同果色材料均以含1～2個抗病基因為主。從本研究得到的數據來看，不同果形和果色的番茄材料在抗病育種上的進展程度相對比較一致。含3～4個抗病基因的30份材料中，紅色大果為12份，占比40%，由此推斷，紅色大果相對較受市場和育種家的重視，抗病聚合育種進展較快。

番茄抗葉霉病育種工作開展得較早。20世紀30年代初，歐美國家已普遍將葉霉病抗性基因用于商業生產。其中Cf-9基因在田間生產中對葉霉病菌多個生理小種的抑制作用均較強，已經被廣泛地導入到栽培番茄優良品種中[23]。王亮等[24]對218份加工番茄骨干自交系材料進行抗病基因檢測，發現其中74份材料含有Cf-9基因，所占比例較大。本研究中Cf-9在不同番茄材料中的存在頻率也較高（達58%），進一步表明Cf-9基因在番茄抗病育種中使用比較廣泛。另外，I-2基因在本研究番茄材料中存在的頻率較高，達53%。I-2基因來源于醋栗番茄（Lycopersicon pimpinelifolium），由于能兼抗番茄枯萎病1號和2號2個主要生理小種，受到育種家的普遍重視，被頻繁用于番茄枯萎病抗性育種，起到了舉足輕重的作用。本研究中的其余3個抗病基因在番茄材料中存在的頻率相對較低（Mi-1為9%;Tm-2a為10%;Ph-3為16%），在今后的育種工作中需加強對這些基因的選擇和應用。

總體來說，與傳統育種方式相比，分子標記輔助育種操作簡便，能加快抗病基因的聚合，提高選種育種的精準性，并能適當縮短育種年限，是一種前景廣闊的農業生物技術手段。本研究利用5個抗病基因的功能標記對234份番茄材料進行了檢測，篩選出的抗病材料可進一步用于多抗聚合育種，再結合所選材料的其他優良性狀表型，為培育多抗、優良的番茄新品種提供參考依據。

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責任編輯：黃東杰