血管內皮生長因子及其基因多態性與腦微出血的關系*

肖慶博 郭 霞 吳麗娥 劉 穎 劉美玉 于文龍 白茹玉 禹延雪

內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古包頭市 014010

腦微出血(Cerebral microbleeds，CMBs)作為腦小血管病的重要影像學分類之一，通常在T2*加權梯度回波序列和SWI上多表現為散在的直徑2～5mm、偶最大達1cm的圓形或類圓形低信號影[1]，且無周圍水腫。在臨床中可無任何癥狀和體征，卻可使患者發生癡呆、認知下降等風險增加[2]，甚至導致患者死亡，故視為一種亞臨床損害。 血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內皮細胞的特異性肝素結合生長因子，具有促進血管內皮細胞分裂增殖進而促進脆弱血管和淋巴管的新生、增加血管通透性等生物學特性。研究發現，VEGF及其基因多態性與糖尿病腎病、增殖性糖尿病視網膜病變等微血管損害風險增加相關[3-4]。腦部微血管和糖尿病損傷腎臟、視網膜微血管有著相似的血流動力學，應變著心室收縮期高壓、高速血流沖擊，故推測腦微出血的發生與VEGF及其基因多態性具有相關性。國內外目前尚無關于VEGF及其基因多態性與腦微出血相關性文獻報道，本研究旨在探討VEGF及VEGF-2578C/A基因多態性與腦微出血的關系，為腦微出血防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將2017年12月—2019年12月于我院神經內二科診治的76例腦微出血患者設為病例組，同期75例無腦微出血患者為對照組，根據2015年《中國腦小血管病診治專家共識》CMBs的影像學標準診斷CMBs：磁共振SWI序列上圓形或卵圓形、質地均一，直徑2～5mm 且周圍無水腫的低信號病灶，并除外顱內鈣化。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)入院完善各項抽血化驗且經頭顱MRI和SWI檢查確診的CMBs患者。排除標準：(1)≤14d的急性腦血管病患者；(2)影像學疑似多發性硬化、視神經脊髓炎等白質變性疾病；(3)經頭顱CT或MRI證實有毛細血管擴張癥、動靜脈畸形、海綿狀血管瘤等血管畸形者；(4)有明確腦外傷病史、腦腫瘤患者；(5)有嚴重多臟器功能衰竭、重癥感染、血液系統疾病、自身免疫疾病；(6)有心臟起搏器者、惡性腫瘤、糖尿病微血管病者；(7)精神異常、癲癇發作等不能配合檢查者。

1.2 主要試劑與儀器 VEGF ELISA試劑盒(Jiangsu Yutong Biological TechnologyCo.,Ltd)、血液基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)、PCR酶預混劑、訂購限制性內切酶BglⅡ，查閱相關文獻及Gegebank數據庫，用primer premier5.0設計VEGF -2578C/A基因位點的引物，并由上海Sangon Biotech公司合成，序列如下：上游引物：5’-GCCTTAGGACACCATACCGATG-3’,下游引物：5’-GCTGCCCCAGGAACAAAGTTG-3’，離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，PCR儀、凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 研究方法 (1)受檢者入院后詳細登記一般信息，記錄既往史，完善血常規、尿常規、血糖、血脂、凝血功能等化驗，完善頭顱核磁、SWI檢查(CMBs由一名影像科專家及兩名高級職稱神經內科醫師共同確定)；(2)第2日晨起6時空腹抽血兩管，一管分離血清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清VEGF 濃度；(3)另一管分離白細胞，使用基因組 DNA 提取試劑盒提取全血DNA；采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測VEGF-2578C/A基因多態性，PCR擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次，最后72℃延伸7min，擴增后使用限制性內切酶Bgl Ⅱ對產物進行酶切。擴增產物及maker行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察片段大小，得出VEGF-2578C/A基因型：CC：285bp，CA：285bp、206bp、79bp，AA：206bp、79bp。見圖1。

圖1 VEGF -2578C/A基因型

2 結果

2.1 兩組基線資料及VEGF濃度情況 兩組性別、糖尿病與否差異無統計學意義(P>0.05)，白細胞計數、甘油三酯、高密度脂蛋白、血肌酐差異無統計學意義(P>0.05)，未予列出；年齡、高血壓、VEGF差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 二元Logistic回歸分析 以CMBs為應變量，將年齡、高血壓病、血清VEGF濃度作為自變量，作多因素非條件Logistic回歸分析后顯示年齡、高血壓仍與CMBs的發生相關，且血清VEGF濃度是CMBs發生的獨立危險因素。見表2。

表2 影響CMBs發生的多因素Logistic回歸分析

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗 應用Hardy-Weinberg公式計算兩組VEGF-2578C/A基因型頻率觀察與對照數，兩者間差異無統計學意義(P>0.05)，表明本研究對照組資料具有群體代表性。

2.4 基因型分析 兩組VEGF-2578C/A位點等位基因(C/A)和基因型(CC、CA、AA)分布，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。校正混雜因素后行多因素Logistic回歸，與AA基因型相比，CC基因型為CMBs發生的易感基因(P<0.05，OR=4.714,95%CI：1.611～13.796)；與CC基因型相比，AA基因型為保護基因(P<0.05，OR=0.212,95%CI：0.072～0.621)。

表3 兩組VEGF基因型和等位基因比較[n(%)]

3 討論

近年來神經科對腦小血管病的研究可謂炙手可熱，尤其是微出血。研究表明CMBs在中老年人群患病率為11.1%～15.3%，隨著年齡的增長或合并有阿爾茨海默病、其他腦血管病其患病率均有不同程度的升高[5]；目前關于CMBs發病的確切機制尚不甚明確，普遍認為高血壓和腦血管淀粉樣變與CMBs的發生密切相關；最新關于腦小血管病發病機制的文獻比較認可可能與慢性缺血/低灌注假說、血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)損害及遺傳等因素[6]相關，與前人研究CMBs發生的病理機理基本一致。由于長期缺血，各種炎性因子釋放，血管內皮功能破壞，BBB通透性增高等單獨或一系列級聯反應，最終導致CMBs發生。血腦屏障主要由緊密連接的血管內皮細胞、星形膠質細胞及神經元等形成的神經血管單元，是腦內穩態的重要結構[7]。VEGF作為一種重要炎癥因子，必然參加了CMBs發生過程。VEGF是已知的促進血管生成最強的因子之一，亦有很強的血管通透誘導作用，VEGF水平升高是BBB通透性增加關鍵環節，國外學者最新研究通過動物實驗利用高滲鹽水介導內皮細胞—一氧化氮合酶通路探討改善腦水腫的可能機制發現，高滲鹽水通過抑制VEGF及其蛋白表達水平下調進而阻斷上述通路，使BBB通透性降低從而減輕腦水腫[8]；另一方面，由于缺血缺氧，促進VEGF、PDGF等血管生成因子產生，并與內皮細胞膜受體結合促進血管生成，同時此種條件下基質金屬蛋白酶等多種內皮細胞損傷標志物[9]相應產生，它們之間的不平衡、不協調就會導致內皮細胞功能障礙，造成新生血管不成熟、不穩定、功能差而促發CMBs。由此可推測，VEGF必然參與了CMBs的形成。

目前關于VEGF基因多態性的研究，國內外優秀學者已經發掘到諸多疾病領域，例如糖尿病視網膜病變、腦卒中、癌癥、子宮內膜異位癥及多囊卵巢綜合征等婦科疾病。Dai C等[10]發現VEGF-C基因多態性與類風濕關節炎關系密切，同時記載VEGF-C基因多態性同口腔癌、尿路上皮細胞癌和冠狀動脈疾病的發生相關，且可作為預測疾病的靶點；外國學者[11]通過分析玻璃體內注射抗VEGF治療年齡相關黃斑變性效果的不同，測試出VEGF通路中各基因單核苷酸多態性不同，也不難預測VEGF與年齡相關性黃斑變性有關。

本研究基于前人關于VEGF及其基因多態性和糖尿病腎病、視網膜等微血管損傷相關的研究，考慮腦部微血管與這些微血管生理及解剖的相似性，再次明確了VEGF的升高可能是CMBs發生的獨立危險因素，證實了VEGF-2578C/A基因有CC、CA、AA三種基因型，運用Hardy-Weinberg平衡檢驗各組基因型，差異無統計學意義，證明具有群體代表性。而且校正混雜因素后CC基因型者CMBs發病率顯著高于AA型，且為AA型的4.714倍，提示C等位基因可能是CMBs的易感基因。有文獻記載Hcy可能也是CMBs的危險因素，本實驗兩組Hcy水平則無明顯差異，可能原因為前人大多研究均是基于腦梗死合并CMBs病例，Hcy水平受腦梗死的影響較大，以及本實驗對象的選擇可能存在入院率偏倚造成，因此本實驗尚不能得出Hcy是CMBs發生的危險因素的證據。

血清VEGF濃度及VEGF-2578C/A基因多態性可能與CMBs的發生具有相關性。因本研究尚存在局限之處：研究為單中心的創新性研究，樣本量偏小，針對CMBs復雜的發病機制，不足以說明具體問題；且研究為單調的VEGF-2578C/A基因位點，難以校正或消除VEGF基因其他位點多態性、VEGF家族基因甚至機體各種因子間相互作用產生的可能影響。若將VEGF-2578C/A作為CMBs發生的預測指標需要后續進行多中心、大樣本量、多基因位點分析更具說服力，但也無疑為CMBs的治療提供了新思路，對傳統危險因素進行嚴格控制或許仍然是治療或預防CMBs的主要方法，由本研究可知未來CMBs的防治應考慮以內皮細胞功能、BBB 和微血管本身功能為靶點。可以大膽想象，未來是否可以采用針對抗VEGF基因多態性治療，或人為注射消除VEGF因子的“新藥物”治療，但具體注射的部位及量，值得后繼者們長期不懈的艱辛探索。