懷玉山高山馬鈴薯脫落酸和環境脅迫誘導蛋白基因的克隆和序列分析

尹明華，盧詠琪，羅懌文，潘巧玲，邱夢婷，蘇 格，譚佳思，涂 慧，蔡 紅，陳榮華

(1.上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；3.上饒市薯芋類作物種質保存與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；4.上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334001；5.上饒市紅日農業開發有限公司，江西 上饒 334700)

【研究意義】高山蔬菜是指在高山地區海拔較高的區域種植的蔬菜，生態、錯季、綠色、味美質優，深受廣大消費者喜愛[1]。高山地區受海拔、地形以及地勢影響導致其生境比較惡劣，如強日輻射、紫外線強烈、晝夜溫差和濕度變化幅度較大、氣壓低、風強、生長周期短等[2]。因此，高山蔬菜需要選擇抗逆好、抗病強、耐儲存、經濟價值高的蔬菜品種。懷玉山高山馬鈴薯是種植于懷玉山區一種高山馬鈴薯，俗稱麻籽洋芋，為國家地理標志農產品，只能適于高山地區種植，移種到平原地區容易造成品種變異，無法保證其原有的品質和風味[3]。懷玉山高山馬鈴薯是藥食兼優的高山蔬菜。食用，營養全面，味甘可口；藥用，健脾利濕、降糖降脂[4]。2015年，馬鈴薯主糧化戰略正式啟動，馬鈴薯成為我國第四大主糧作物。在此主糧化背景下，做大做強懷玉山高山馬鈴薯產業具有重要的現實意義。【前人研究進展】高山蔬菜在高海拔逆境脅迫誘導因子的作用下會產生、傳遞和翻譯高海拔逆境脅迫誘導信號，誘導相關基因轉錄表達，最終產生一些誘導蛋白以全面提高其防御能力[5]。植物激素信號是通過一個復雜的網絡傳遞的，該網絡具有相當大的串擾，有助于對環境響應進行所需的微調和調節，具生物活性的油菜素內酯(BL)和脫落酸(ABA)在內的油菜素類固醇激素(BR)主要參與植物的生長和發育以及植物的防御反應[6]。脫落酸被認為是控制植物對各種環境脅迫(包括水分虧缺、鹽分、傷害和低溫)適應性反應的常用介質，脫落酸在重要的作用不僅是介導一些生理過程，如種子萌發和在不利環境條件下，在遺傳水平上也調節植物的適應性反應[7]，逆境脅迫發生時，ABA 與 ABA 結合蛋白快速結合，感知和傳遞環境信號，啟動植物體內各種生理生化反應，提高植物抗逆能力[8]。【本研究切入點】目前在馬鈴薯克隆了“脫落酸、脅迫、成熟誘導基因”(Abscisic acid, stress, ripening inducible genes，ASR)[9-10]。關于馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白(abscisic acid and environmental stress inducible protein)未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究從構建的懷玉山馬鈴薯轉錄組數據庫中挑選脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因序列，采用 RT-PCR技術克隆脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因的全長序列，并對脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因結構和翻譯產物進行生物信息學分析。此研究結果以期為進一步研究脫落酸與環境脅迫誘導蛋白在懷玉山高山馬鈴薯在高山高海拔環境逆境脅迫中調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

懷玉山高山馬鈴薯試管苗(上饒師范學院生命科學學院植物組織培養室提供)、Trizol 總 RNA 提取試劑、PCR 反應 2 × GoldStarTaqMasterMix 購 自 北 京 康 為 世 紀 公司；M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑、PrimeScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)、PMD18-T vector 及 SYBR?Premix ExTaqTM II 均購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自 Omega公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α 由本實驗室保存；其他常規試劑均為國產分析純試劑。

1.2 總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

用Trizol 試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉錄引物用 Oligo(dT)18 Primer：5′-GGCCACGC GTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進行。

1.3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因基因的克隆

利用懷玉山高山馬鈴薯試管苗轉錄組數據庫篩選到脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因基因的核心片段，運用 Primer Premier 5.0 設計基因特異性引物(F：ATGGCACAATACGGCAACCA；R：TCAATGCATCCCAGGGATCTT)。PCR擴增條件：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 4 min 30 s)(35個循環)；72 ℃ 10 min。PCR 產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉化到感受態細胞E.coliDH5α，經鑒定正確的陽性轉化子提取質粒送往上海生工進行測序。

1.4 生物信息學分析

按照張林等[11]方法對懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因進行氨基酸序列分析、理化性質分析、結構預測、功能分析。

2 結果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯RNA 提取

由圖 1可以看出，RNA條帶清晰，無色素、蛋白、糖類等雜質污染，28/23S亮度大于18/16S，濃度為602.00 ng/μL，總量為18.06 μg，RIN值=8.4，OD260/OD280=2.17，OD260/OD230=2.22，表明提取的RNA較為完整，質量較高，可以進行后續實驗。

圖1 懷玉山高山馬鈴薯總RNA電泳

2.2 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因cDNA序列

由圖2～4顯示，通過PCR擴增技術，懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因cDNA總長度為423 bp，G+C 含量為52.25%。

圖2 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因PCR擴增

圖3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因堿基組成

圖4 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因各堿基的比例

2.3 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白氨基酸序列

由圖5顯示，Protparam預測懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白由140個氨基酸組成，分子量14 534.01 Da，等電點7.07，為親水性蛋白。各氨基酸的數目和比例為Ala(A)(3，2.1%)、Arg(R)(5，3.6%)、Asn(N)(2，1.4%)、Asp(D)(7，5.0%)、Cys(C)(0，0.0%)、Gln(Q)(14，10.0%)、Glu(E)(9，6.4%)、Gly(G)(38，27.1%)、His(H)(7，5.0%)、Ile(I)(3，2.1%)、Leu(L)(1，0.7%)、Lys(K)(11，7.9%)、Met(M)(16，11.4%)、Phe(F)(0，0.0%)、Pro(P)(2，1.4%)、Ser(S)(7，5.0%)、Thr(T)(12，8.6%)、Trp(W)(0，0.0%)、Tyr(Y)(2，1.4%)、Val(V)(1，0.7%)、Pyl(O)(0，0.0%)、Sec(U)(0，0.0%)。帶負電殘基總數(Asp+Glu)為16，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為16。原子組成：碳(C)580，氫(H)942，氮(N)196，氧(O)210，硫(S)16；分子式：C580H942N196O210S16，原子總數：1944。消光系數：這種蛋白質不含任何Trp殘基。經驗表明這可能導致計算消光系數的誤差超過10%。消光系數以M-1·cm-1為單位，在水中測量的280 nm處。外部系數2980，絕對值0.1%(= 1 g/L)0.205。估計半衰期所考慮序列的N端是M(Met)。估計半衰期為：30 h(哺乳動物網織紅細胞，體外)。>20 h(酵母，體內)。>10 h(大腸桿菌，體內)不穩定指數：失穩指數(II)計算為34.82，這將蛋白質分類為穩定的。

圖5 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白氨基酸序列

脂肪指數15.36，總平均親水性為-1.268。

2.4 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白親疏水性分析

從圖6可知，高峰值(正值)的區域表示疏水的區域，而負值的“低谷”區域是親水區域。疏水性結果分析表明，最大疏水值為0.3左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強；親水峰最大值為-3左右，整個蛋白質表現出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白質。

圖6 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白親疏水值分布

2.5 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白二級結構分析

由圖7顯示，GOR 預測顯示其二級結構由α-螺旋(Alphahelix，Hh，21.43%)、β-片層(Extendedstrand，Ee，24.29%)、無規則卷曲(Randomcoil，Cc，54.29%)構成。從分布位點上來看，由圖8顯示，C端和N端含無規則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質中。

圖7 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白二級結構

藍色代表 α-螺旋；紅色代表β-片層；紫色代表不規則卷曲

2.6 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白三級結構分析

由圖9顯示，SWISS-MODEL預測顯示懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白的三級結構為單聚體。

圖9 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白三級結構

2.7 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白亞細胞定位

圖10顯示，采用 Psort在線軟件對懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因的表達部位進行預測，結果為定位于細胞核中的數量為10，細胞外的數量為2，細胞質中的數量為1，質膜中的數量為1，表明懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白主要存在細胞核中。

2.8 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白系統進化分析

從圖11可見，懷玉山高山馬鈴薯與Solanumtuberosum(馬鈴薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like、S.tuberosum(馬鈴薯)TAS14肽、S.tuberosum(馬鈴薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14和Vibrioparahaemolyticus(副溶血性弧菌)hypothetical protein(假定蛋白)在一個大分支下，這說明懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白在進化上與馬鈴薯和副溶血性弧菌的親緣關系較近，尤其是與馬鈴薯(S.ltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在進化上具有最高的親緣關系。

圖11 懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白系統進化分析

3 討 論

脫落酸(ABA)可以誘導一系列基因表達介導植物對環境的反應壓力[12]。大麥(HordeumvulgareL.)的一個早期ABA誘導基因HVA22與其他ABA反應基因如LEA(晚期胚胎發生豐富)和RAB(對ABA反應)基因幾乎沒有同源性，ABA和環境因素可誘導HVA22在營養組織中的表達壓力，如寒冷和干旱[13]。干旱脅迫下智利番茄葉片中鑒定出一個滲透脅迫和脫落酸應答的內切酶(EC 3.2.1.14)基因家族成員，966 bp全長cDNA(命名為pcht28)編碼一種帶有氨基末端信號肽的酸性幾丁質酶前體，預測成熟蛋白含有229個氨基酸殘基，相對分子質量24 943，pI值6.2。序列分析表明，pcht28與番茄和煙草中的Ⅱ類幾丁質酶(EC 3.2.1.14)具有高度同源性。pcht28蛋白在大腸桿菌中的表達證實了它確實是一種幾丁質酶。pcht28編碼的幾丁質酶除了具有一般的防御功能外，還可能在水分脅迫下的植物發育或保護植物免受病原菌侵染方面發揮特殊作用[14]。脫落酸、脅迫和成熟誘導蛋白(ASR)是一類低分子量的植物特異性蛋白，芒果ASR基因的全長cDNA序列(MiASR)包含516個核苷酸的開放閱讀框(ORF)，編碼172個氨基酸殘基，可能參與芒果果實成熟和采后生理[15]。旱脅迫和脫落酸誘導的番茄基因le16包含單個開放閱讀框能夠編碼12.7 kDa的多肽，富含亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸，等電點為8.7，氨基末端是疏水性的，具有信號序列的特征，其靶向多肽從細胞質中輸出[16]。在擬南芥中，脫水反應基因rd22的誘導是由脫落酸(ABA)介導的，rd22啟動子的67 bp DNA片段足以用于脫水和ABA誘導的基因表達，獲得了一個編碼MYC相關DNA結合蛋白的cDNA(rd22BP1)，編碼一個68 kd蛋白，具有典型的堿基區螺旋環螺旋亮氨酸拉鏈基序的DNA結合域。另外還獲取一個干旱和ABA誘導的基因可以編碼MYB相關蛋白ATMYB2，實驗證明rd22BP1(MYC)和ATMYB2(MYB)蛋白在rd22基因的脫水和ABA誘導表達中都起轉錄激活作用[17]。利用噬菌體原位雜交技術，從干旱處理小麥幼苗cDNA文庫中克隆了一個水分脅迫誘導基因W89，全長cDNA 2392 bp，包含一個1896 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼631個氨基酸蛋白，保守區為DUF248(pfam03141)，W89與水稻脫水反應蛋白BAD67956的同源性為66%[18]。經低溫、干旱、鹽脅迫和傷害脅迫處理的紫花苜蓿幼苗，不經高溫處理，會誘導產生與代表性cDNA相對應的RNA(pUM90-1)，ABA和ABA類似物可以迅速誘導pUM90-1基因的表達，這些cDNA克隆可編碼一組可被ABA和多種環境脅迫誘導的蛋白質，并對應于一個新的植物基因家族，即ABA和環境脅迫誘導基因[19]，并且其中一種苜蓿ABA和環境脅迫誘導基因的初級結構被確定[20]。ABA和環境脅迫誘導基因Tas14在番茄儲存早期可以誘導表達，Tas14基因也被認為是在ABA或環境脅迫下積累，可以與含有酸性磷脂的脂質囊泡結合，清除羥自由基或對脂質膜具有抗過氧化保護作用[21]。馬鈴薯防御激素反應的轉錄參考圖譜也表明，ABA的應用對馬鈴薯轉錄物豐度的影響最大，ABA共誘導492個基因，下調264個基因，植物中參與ABA途徑的基因被強烈上調，例如ABA和環境脅迫誘導蛋白TAS14(DMG400003530)上調1720倍[6]。本試驗結果進一步充實了這個研究結果。在本研究中，懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白基因cDNA總長度為423 bp，G+C 含量為52.25%；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白由140個氨基酸組成，分子量14 534.01Da，等電點7.07，為親水性蛋白；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白二級結構由α-螺旋(21.43%)、β-片層(24.29%)、無規則卷曲(54.29%)構成；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白的三級結構為單聚體；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白主要存在細胞核中；懷玉山高山馬鈴薯脫落酸與環境脅迫誘導蛋白在進化上與馬鈴薯和副溶血性弧菌的親緣關系較近，尤其是與馬鈴薯(Solanumltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在進化上具有最高的親緣關系。