枯草芽孢桿菌對斜紋夜蛾生長發育及消化酶活性的影響

馬自杰，張婉婷，廖美德

(華南農業大學 農學院，廣東 廣州 510642)

【研究意義】食料對昆蟲生長發育的影響不僅僅表現在發育歷期、蛹重、卵孵化率等外在方面，也與其自身的中腸消化酶活力、營養效應等息息相關[1-3]。因此，深入探究昆蟲對食料的嗜食性和適應程度，對于控制昆蟲種群興衰具有重要作用[4]。【前人研究進展】目前，通常將采集到的昆蟲在實驗室條件下采用人工飼料飼育以進行不同類型的研究。在昆蟲的人工飲食中添食抗生素、維生素以及一些激素類等添加物是實驗室昆蟲飼育及生物學研究的關鍵組成部分[5-9]。有研究表明，在家蠶的人工飼料中添食KI、BCH(蠶促9號)、糖類物質以及L-酪氨酸等有利于提高家蠶的全繭量、蛹重以及解舒率等[10-13]，這對于家蠶的的生長發育具有正向效應。此外，另有相關研究表明，微生物也可作為飼料添加劑應用到動物等飼育中。例如，恩普爾NM-I原液微生態制劑(含枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌等菌種)作為理想的抗生素替代品[14]，被廣泛用作于動物飼料添加劑。而將其發酵液添食昆蟲后，對家蠶等昆蟲生長發育也具有一定促進作用[14]。最近，也有相關研究顯示出添食枯草芽孢桿菌雖對家蠶生長發育具有一定正向效應，但在家蠶繭層率等方面呈現出負向效應[15]。芽孢桿菌屬等作為家蠶、斜紋夜蛾等鱗翅目昆蟲腸道的定植菌屬，對宿主發育、營養和生理等諸多方面產生重要影響。昆蟲腸道微生物作為昆蟲與微生物在長期進化過程中形成的蟲菌共生體系中的重要組成部分，可以分泌多種消化酶，在昆蟲營養消化吸收等方面發揮著直接或間接的作用，尤其是在農業生態調控等方面，其與宿主在免疫、代謝、發育等方面的相互作用，是很好的研究模型[16]。枯草芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種，具有很強的耐逆性，是微生物中可百分之百直達腸道的活菌。同時，枯草芽孢桿菌還具有較好的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纖維素酶活性，可以幫助宿主更好的利用營養物質[17]。【本研究切入點】枯草芽孢桿菌目前雖已被廣泛用作于動物飼料添加劑，但是在實驗室昆蟲飼育以及昆蟲生物學研究等方面涉足較少。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過制備不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾初孵幼蟲進行飼育，直至化蛹，研究斜紋夜蛾以不同含菌量人工飼料進行飼育對其營養消化、中腸消化酶活性、生長發育等指標的影響。此研究為下一步實驗室昆蟲飼育以及生物防治等方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲源。斜紋夜蛾幼蟲由華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室提供，并在人工氣候培養箱[T(26±2)℃、RH(80±5)%、14L:10D]內采用人工飼料進行連續多代培養，幼蟲期每天更換新鮮飼料，并對養蟲盒進行清潔消毒處理。成蟲放入內表面貼有硫酸紙的10L透明塑料桶中進行交配產卵，并在桶底部放置10%蜂蜜水給予成蟲取食。選擇健康及發育一致的初孵幼蟲進行試驗。

供試菌種。供試枯草芽孢桿菌由華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室提供并保存。

1.2 含枯草芽孢桿菌人工飼料配制

斜紋夜蛾人工飼料的配制在朱麗梅[18]等人飼養方法的基礎上稍作修改，并加入枯草芽孢桿菌菌懸液配制成菌落數量分別為6×108，6×106和6×104cfu/g的含菌飼料，以不含菌的人工飼料作為對照(CK)。

1.3 幼蟲營養指標測定

分別從以不同含菌量人工飼料飼養的斜紋夜蛾幼蟲中選取剛蛻皮進入四齡且健康發育一致的幼蟲，并饑餓過夜：分別從不同含菌量(含對照組)人工飼料飼養的斜紋夜蛾幼蟲中各選取10頭稱取鮮重，并在80 ℃烘箱中烘干至恒重，測定其干濕比；再分別各選取10頭幼蟲并稱取幼蟲鮮重，根據所測幼蟲干濕比推測出試前幼蟲干重(C)，然后分別飼以不同含菌量(含對照組)的人工飼料，48 h后分別取出殘余飼料和糞便，并將試蟲和糞便在80 ℃條件下烘干至恒重，以此測得試后糞便干重(E)和幼蟲干重(D)；基于以上同樣方法，可以測得試前(A)和試后(B)不同含菌量飼料干重。

營養指標的測定參照朱俊洪[19]：

每處理用蟲20頭，重復3次。

1.4 幼蟲中腸消化酶活性測定

1.4.1 中腸粗酶液的制備 分別選取發育一致且經饑餓過夜處理后的待測幼蟲，每20頭為一次重復，共3次重復，在超凈臺上將幼蟲體表進行消毒漂洗后于冰浴中迅速解剖。然后用預冷的相應酶緩沖液沖洗去幼蟲腸道外表面體液，用無菌解剖剪，剪取幼蟲中腸，將其置于預加有5 mL預冷相應酶緩沖液的玻璃勻漿器迅速勻漿。最后將勻漿液等量分裝于1.5 mL離心管中并置于高速冷凍離心機上4 ℃，10 000 r/min,離心10 min。離心后取上清液即為粗酶液。

1.4.2 淀粉酶 取200 μL 2%淀粉, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH6.0)，800 μL酶液,室溫下反應10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水楊酸終止反應，然后沸水浴5 min，于550 nm波長測吸光值。無酶反應體系用0.2 mol/L PBS(pH6.0)代替酶液，作為對照(CK)。每處理3次重復，取平均值。

1.4.3 海藻糖酶 取200 μL 3%海藻糖, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH 5.8)，800 μL酶液,室溫下反應10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水楊酸終止反應，然后沸水浴5 min，于550 nm波長測吸光值。無酶反應體系用0.2 mol/L PBS(pH 5.8)代替酶液，作為對照(CK)。每處理3次重復，取平均值。

1.4.4 蔗糖酶 取200 μL 4%蔗糖, 800 μL 0.2 mol/L PBS(pH 5.8)，800 μL酶液,室溫下反應10 min后，置于37 ℃水浴60 min，加1 mL 3,5-二硝基水楊酸終止反應，然后沸水浴5 min，于550 nm波長測吸光值。無酶反應體系用0.2 mol/L PBS(pH 5.8)代替酶液，作為對照(CK)。每處理3次重復，取平均值。

1.5 斜紋夜蛾生長發育的測定

選取健康且生長發育一致的初孵幼蟲，分別用不同含菌量的人工飼料進行飼養，每處理20頭，3次重復。羽化后，雌雄按1∶1配對進行交配產卵，并在交配桶中放置10%蜂蜜水給予營養補充。每天按時進行觀察、飼養，記錄斜紋夜蛾不同蟲態發育歷期、蛹重以及產卵量等。

1.6 數據處理

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，并利用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同含菌量人工飼料對4齡幼蟲的營養效應

從表1可以看出，取食不同含菌量人工飼料幼蟲相對取食率依次為CK組>6×104cfu/g組>6×108cfu/g組>6×106cfu/g組，且取食含菌量人工飼料6×106cfu/g組顯著低于其余各組；取食不同含菌量人工飼料幼蟲食物轉化率和食物利用率分別依次為6×106cfu/g組>CK組>6×104cfu/g組>6×108cfu/g組，且取食含菌量人工飼料6×106cfu/g組顯著高于其余各組；取食不同含菌量人工飼料幼蟲相對生長率和近似消化率分別依次為CK組>6×106cfu/g組>6×104cfu/g組>6×108cfu/g組，且取食含菌量人工飼料6×108cfu/g組顯著低于其余各組，同時其余各組之間不存在顯著性差異。

表1 不同含菌量人工飼料對4齡幼蟲的營養效應

從表2可以看出，取食不同含菌量人工飼料幼蟲平均鮮重依次為6×106cfu/g組>6×108cfu/g組>6×104cfu/g組>CK組，且取食含菌量人工飼料6×106cfu/g組4齡幼蟲平均鮮重顯著高于其余各組。

表2 不同含菌量人工飼料對4齡幼蟲均重的影響

2.2 不同含菌量人工飼料對幼蟲中腸消化酶活性的影響

從表3可以看出，不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾不同蟲齡幼蟲中腸消化酶活性的影響有所不同。取食不同含菌量人工飼料2齡幼蟲淀粉酶活力依次為6×104cfu/g組>6×106cfu/g組>CK組>6×108cfu/g組，且取食含菌量人工飼料6×104cfu/g組和6×106cfu/g組顯著高于其余各組；取食不同含菌量人工飼料2齡幼蟲海藻糖酶活力依次為6×104cfu/g組>6×106cfu/g組>CK組≥6×108cfu/g組，且取食含菌量人工飼料6×106cfu/g組與其余各組之間均不存在顯著性差異；取食不同含菌量人工飼料2齡幼蟲蔗糖酶活力依次為6×106cfu/g組>6×104cfu/g組>6×108cfu/g組>CK組，且取食含菌量人工飼料6×104和6×106cfu/g組顯著高于CK組；取食不同含菌量人工飼料4齡幼蟲淀粉酶活力依次為6×104cfu/g組>6×108cfu/g組>6×106cfu/g組>CK組，且取食含菌量人工飼料6×104cfu/g組淀粉酶活顯著高于其余各組；取食不同含菌量人工飼料4齡幼蟲海藻糖酶活力依次為6×104cfu/g組>6×106cfu/g組>6×108cfu/g組>CK組，且取食3種不同含菌量人工飼料幼蟲海藻糖酶活力均顯著高于CK組；取食不同含菌量人工飼料4齡幼蟲蔗糖酶活力依次為6×108cfu/g組>6×106cfu/g組>6×104cfu/g組>CK組，且取食含菌量人工飼料6×108cfu/g組蔗糖酶活力顯著高于CK組。

表3 不同含菌量人工飼料對幼蟲中腸消化酶活性的影響

2.3 不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾生長發育的影響

2.3.1 不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾發育歷期的影響 從表4可以看出，取食不同單位飼料含菌量人工飼料的斜紋夜蛾幼蟲歷期依次為CK組>6×106組>6×108組>6×104組；蛹歷期依次為6×104組>6×106組>CK組>6×108組；成蟲歷期依次為6×104組>6×108組>6×106組>CK組；卵歷期依次為6×104組>CK組>6×108組>6×106組；世代總歷期依次為6×104組>6×108組>6×106組>CK組；表明，6×104組斜紋夜蛾發育歷期最長，6×106以及6×108組次之，CK組斜紋夜蛾發育歷期最短；其中，在幼蟲和蛹歷期，6×108、6×106以及6×104組這3組與對照相比均無顯著差異；在成蟲歷期，6×104和6×108組成蟲歷期均與對照相比均存在顯著性差異，而6×106組與對照相比卻未表現出顯著性差異；在卵歷期，僅6×106組與對照相比均存在顯著性差異；在世代總歷期，僅6×104組與對照相比表現出顯著差異。

表4 不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾發育歷期的影響

2.3.2 不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾蛹及卵的影響 從表5可以看出，在喂食不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾蛹的影響方面，其化蛹率、雌雄比(雌/雄)以及蛹羽化率各組之間均達到顯著性差異；在蛹重方面，6×104、6×106組這2組雌蛹重均與對照相比達到顯著性差異，而6×108組與對照相比卻未表現出顯著性差異；在雄蛹重方面，僅6×106組與對照相比達到顯著性差異，其余各組之間差異不明顯；在喂食不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾卵的影響方面，6×108、6×106以及6×104組這3組單雌產卵量與對照相比均表現出顯著性差異，其中6×108、6×106組這2組之間單雌產卵量差異不明顯；在卵孵化率方面，6×104組與其余各組之間均達到顯著性差異，而6×108組、6×106以及CK組這3組之間在卵孵化率方面未表現出明顯差異。

表5 不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾蛹及卵的影響

3 討 論

研究結果表明，喂食不同含菌量人工飼料以CK組飼育的幼蟲化蛹率以及蛹羽化率最低，蟲/蛹重最輕，單雌產卵量最小；而以6×106組飼育的幼蟲化蛹率以及蛹羽化率最高，蟲/蛹重最重，單雌產卵量最大。同時，以6×106組飼育的幼蟲在世代總歷期上與CK組飼育的幼蟲無顯著差異。因此，取食單位飼料含菌量為6×106cfu/g的人工飼料可能最適宜斜紋夜蛾生長發育，而在取食單位飼料含菌量分別為6×108、6×104cfu/g的人工飼料時，對斜紋夜蛾生長發育也有相對較好的促進作用，且在化蛹率、羽化率以及產卵量等方面優于以CK組飼育的。

枯草芽孢桿菌作為微生物中可百分之百直達腸道并定植的活菌，可參與昆蟲腸道菌群動態平衡調節，而腸道菌群對昆蟲的營養效應是極為重要的因素[20-21]。某些昆蟲腸道微生物(例如：從斜紋夜蛾幼蟲腸道分離出的甲基營養菌等)有助于其體內消化酶的產生[22-24]。昆蟲腸道海藻糖酶、蔗糖酶等消化酶活力的增加在一定程度上可提高攝取食物轉化為昆蟲生物量的效率[5]，而食物轉化率等營養指標在一定程度上反映了昆蟲對宿主的喜食利用以及自身發育優劣程度[4,25]。本研究發現，喂食不同含菌量人工飼料以6×106組飼料飼育的幼蟲相對取食率顯著低于其余各組；而在食物轉化率和食物利用率方面，以6×106組飼料飼育的幼蟲卻均顯著高于其余各組。由此推斷，斜紋夜蛾幼蟲這種較高的食物轉化率和食物利用率可能是對其低取食量的一種生理補償的結果[26]，同時，在其取食量顯著低于其他組的情況下，仍能有較高的生物量(即幼蟲重)，說明斜紋夜蛾幼蟲可以高效地將食物轉化為蟲體組織[27]。此外，蛹重作為衡量幼蟲期營養質量的重要指標，可以從側面反映出斜紋夜蛾幼蟲期生長發育質量。研究發現，以6×106組飼料飼育的幼蟲化蛹后相較于其余各組無論雌/雄蛹均具有較高的蛹重，表明斜紋夜蛾幼蟲取食單位飼料含菌量為6×106cfu/g人工飼料可獲得較好的營養質量。因此，單位飼料含菌量為6×106cfu/g人工飼料對斜紋夜蛾幼蟲可能有較好的取食適合度。在幼蟲相對生長率和近似消化率方面，喂食不同含菌量人工飼料的幼蟲之間總體差異不明顯，導致這一現象的原因可能與其體內消化酶活性有關[4]。以6×106組飼料飼育的幼蟲雖然具有較高的相對生長率、食物轉化率和食物利用率，但其卻沒有表現出較高的海藻糖酶、蔗糖酶等消化酶活性；這可能與其自身腸道微生物變化以及機體生長補償機制有關，具體原因有待進一步探究。

研究發現，斜紋夜蛾4齡幼蟲中腸消化酶活力要高于2齡幼蟲，這可能與其自身食量增加有關；同時，斜紋夜蛾幼蟲取食不同含菌量人工飼料均能正常完成生活世代。相較于對照組(CK)，取食不同含菌量人工飼料對斜紋夜蛾生長發育以及消化酶活性均具有較好的促進作用，但對其世代總歷期具有一定延滯效應。此外，取食單位飼料含菌量為6×106和6×108cfu/g組飼料均可顯著降低斜紋夜蛾雌雄比(雌/雄)，其中以取食單位飼料含菌量為6×106cfu/g組最佳[其雌雄比(雌/雄)為0.77]。因此，下一步對取食單位飼料含菌量為6×106cfu/g人工飼料的幼蟲機體補償機制以及導致其低雌雄比的原因進行深入探究分析，這將為之后實驗室昆蟲飼育以及病蟲生物防治等方面提供重要理論指導。

4 結 論

斜紋夜蛾幼蟲取食單位飼料含菌量為6×106cfu/g人工飼料對其生長發育及中腸酶活力等具有明顯的促進作用，因此單位飼料含菌量為6×106cfu/g人工飼料對斜紋夜蛾幼蟲具有較好的取食適合度。