馬鈴薯早疫病拮抗細菌的篩選、鑒定及抑菌物質研究

2021-08-05 13:51:30于水清楊毅清龐民好楊志輝朱杰華

西南農業學報 2021年6期

于水清，楊毅清，張岱，龐民好，楊志輝，朱杰華

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071000)

【研究意義】馬鈴薯早疫病是由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起的一種氣傳病害，是僅次于馬鈴薯晚疫病的第二大氣傳病害。在我國馬鈴薯生產中的危害程度日趨嚴重，平均每年發病面積約為90萬公頃[1]。該病不僅可以為害馬鈴薯植株葉片，還可危害馬鈴薯莖稈和塊莖[2]。目前，種植抗病品種是馬鈴薯早疫病的防治主要農業防治措施，但是由于馬鈴薯種薯退化嚴重、品種資源有限以及培育抗病品種時間長等因素[3]，導致馬鈴薯抗病品種選育和應用并不理想。化學農藥作為當前病蟲害防治的主要手段，見效快、成本低[4]，但長期大量使用化學農藥，會導致病原菌抗藥性、生態系統失衡和環境污染等問題。芽胞桿菌菌株及其代謝產物對植物病害有較好的防治效果，由于其抗逆性強，已成為生防菌劑的備選資源。生物防治因其具有與環境相容性好、對人畜和天敵安全等優點受到廣泛關注，其中，生防菌的開發與應用是當今農業生產中防治植物病害的熱點。【前人研究進展】近年來，利用芽胞桿菌防治茄鏈格孢菌時有報道。韓龍等[6]發現芽胞桿菌的單菌發酵液和混菌發酵液對茄鏈格孢菌均有抑制作用，其抑制率為62.12%～73.87%。楊繼業[7]等分離得到解淀粉芽胞桿菌BAF-6對馬鈴薯早疫病菌的抑菌圈寬度為24 mm，且BAF-6發酵液具有良好的熱穩定性和紫外穩定性，經蛋白酶處理后抑菌活性仍達50%以上。Umapathy等[8]發現解淀粉芽孢桿菌FZB24可有效提高馬鈴薯的防御酶，對馬鈴薯早疫病有較好的生防效果。【本研究切入點】目前，芽胞桿菌防治氣傳病害的報道較少，芽胞桿菌對于氣傳病害的作用機制尚不完善。【擬解決的關鍵問題】本研究從河北省承德市圍場縣馬鈴薯早疫病發生嚴重的馬鈴薯地塊，定向分離生防菌株，并就其與馬鈴薯早疫病菌互作后的生物學表現進行研究，進一步明確其抑菌活性物質種類及抑菌機理。本研究旨在得到高效抑制馬鈴薯早疫病的生防菌株，以期為馬鈴薯早疫病的生物防治提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品的采集 2016年8月，于河北省承德市圍場縣連作5年馬鈴薯早疫病發生嚴重地塊，用五點取樣法取馬鈴薯植株根際土壤，裝入無菌袋中，4 ℃保存備用。

1.1.2 供試病原菌馬鈴薯早疫病菌Alternariasolani、蘋果斑點落葉病菌A.alternarte、馬鈴薯枯萎病菌Fusariumsambucvnm、梨黑斑病菌A.alternate、馬鈴薯干腐病菌F.sambucinum、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、馬鈴薯黑痣病菌Rhizoctoniasolani、小麥根腐病菌Bipolarissorokiniana、小麥赤霉病菌F.graminearum。均由河北農業大學植物保護學院馬鈴薯病害研究中心提供。

1.1.3 培養基LB培養基氯化鈉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、瓊脂18 g/L；PDA培養基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂18 g/L；TA培養基：番茄125 g/L，瓊脂18 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌的分離與篩選生防菌的分離采用土壤稀釋法[9]，并結合平板對峙法對生防菌進行篩選。將馬鈴薯早疫病菌(直徑5 mm)菌餅，接種于PDA培養皿中央，在距菌餅四周25 mm處放置5 mm濾紙片，接種5 μL生防菌發酵液。以接無菌水為對照，25 ℃培養7 d，測量抑菌圈寬度，每處理重復3次。

1.2.2 生防菌的鑒定菌落形態觀察，將生防菌液稀釋涂布于LB平板上，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態、顏色、隆起形狀和透明度。參照《伯杰氏系統分類手冊》[10]和《常見細菌系統分類手冊》[11]進行生理生化鑒定。

使用全氏金細菌基因組提取試劑盒提取生防菌株基因組DNA，采用gyrB-F(5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’)與gyrB-R(TCCDCCSTAGARTCWCCCTC-3’)擴增gyrB基因[12]。將PCR產物送至上海生工生物工程有限公司完成測序，測序結果在NCBI數據庫中進行 Blast 比對分析并用ClustalX 和MEGA 6.0軟件構建基因樹。

1.2.3 生防因子的測定取1 μL活化的生防菌液，分別接種到酪蛋白培養基、含有1%的可溶性淀粉LB培養基、含有纖維素剛果紅培養基和膠體幾丁質酶培養基上，37 ℃培養48 h，觀察有無透明圈產生，重復3次，拍照記錄結果。

將過夜培養的生防菌接種在Ashby無氮培養皿中，以無菌水為對照，37 ℃培養2～4 d，連續培養3代，觀察培養平皿中是否有菌落產生，重復3次，拍照記錄結果。

取適量的大豆油和蘇丹紅染色劑混勻，向直徑9 cm培養皿中加入適量無菌水，滴加染色后的大豆油。吸取少量生防菌液滴加到油膜中，觀察是否形成排油圈，重復3次，拍照記錄結果。

1.2.4 生防菌發酵液及脂肽粗提物抑菌譜的測定發酵液抑菌譜測定：在培養基平皿中央放置直徑5 mm的病原菌菌餅，四周25 mm處放直徑6 mm的濾紙片。每個濾紙片上分別滴加5 μL菌株發酵液，以點接無菌水為對照，適宜溫度培養至對照長滿皿，測量抑菌帶寬度。

脂肽粗提物抑菌譜測定：采用酸沉淀法[13]提取脂肽粗提物，在培養基平皿中央放置直徑5 mm的病原菌菌餅，距中心25 mm處打孔，加入50 μL脂肽粗提物濾液，以加入50 μL甲醇為對照。適宜溫度培養至對照長滿皿，測量抑菌帶寬度。

1.2.5 生防菌發酵液及脂肽粗提物對馬鈴薯早疫病菌絲的抑制作用發酵液對茄鏈格孢菌絲的影響：將生防菌發酵液稀釋至1×102、1×104、1×106、1×108cfu/mL。在距培養皿中心12.5 mm處分別接種馬鈴薯早疫病菌餅和5 μL菌株C16發酵液稀釋液。以點接無菌水為對照，每個處理3次重復。25 ℃培養7 d，測量抑菌帶寬度。

脂肽粗提物對馬鈴薯早疫病菌絲的影響：配制脂肽粗提物濃度分別為10、5、1、0.5、0.1 mg/mL。接種馬鈴薯早疫病菌餅于培養基中心，距中心25 mm處打孔，分別加入50 μL上述濃度脂肽提取濾液，以加入50 μL甲醇為對照，25 ℃培養7 d，分別測量抑菌帶寬度。每個試驗重復3次。

1.2.6 生防菌中脂肽類物質鑒定及活性成分測定脂肽粗提物采用酸沉淀法提取。將脂肽粗提物進行高效液相色譜(HPLC)分析，采用C18柱(5 μm，250 by 4.6 mm；YYDAC218TP；Hesperia，CA)，流動相為乙腈、水、甲酸，流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量為10 μL。以 Surfactin和Iturin純品進樣進行定性分析。

采用瓊脂擴散法檢測Surfactin、Iturin、Surfactin+Iturin 對茄鏈格孢菌絲的抑制作用。距離PDA培養基中心12.5 mm處接種活化后的5 mm馬鈴薯早疫病菌餅，對稱位置打孔，分別加入50 μL 2.5 mg/mL Surfactin、Iturin以及Surfactin和Iturin混合液(體積比為1∶1)，以加入甲醇為對照，重復3次。

2 結果與分析

2.1 生防菌的分離與篩選

從5份土壤樣品中共篩選得到對早疫病菌有抑制作用的拮抗菌74株，經篩選得到一株抑菌效果最為穩定、拮抗效果最好的生防菌，命名為C16，其對馬鈴薯早疫病菌的抑菌圈寬度可達31.5 mm(圖1)。

1.對峙培養；2.對照

2.2 菌株C16的鑒定

菌株C16在LB培養基培養24 h后，形成近圓形、具有乳白色菌膜的菌落，表面有褶皺，四周有凸起中間略有凹陷。菌株C16形態呈短桿狀，革蘭氏染色陽性(圖2)。

1.C16 菌落；2.革蘭氏染色

菌株C16生理生化測定結果如表1所示，其生理生化指標符合《伯杰氏系統分類手冊》和《常見細菌系統分類手冊》中對芽胞桿菌屬的描述。

表1 菌株C16的生理生化特征

以菌株C16的總DNA為模版，通過PCR獲取gyrB基因片段，測序后將數據提交至GenBank數據庫進行Blast比對結果顯示，該菌株與多種芽胞桿菌Bacillus有較高的同源性，通過MEGA6.0構建最大簡約法Maximum parsimony基因樹(圖3)，其中與貝萊斯芽胞桿菌(B.velezensis)同源性最高，故鑒定菌株C16為貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis。

圖3 MEGA 6.0構建菌株C16的基因樹

2.3 菌株C16生防因子的測定

由圖4所示，經碘液染色，菌株C16在含有淀粉的培養基培養，可看到明顯的透明圈，說明該菌株可產生淀粉酶；菌株C16在無氮培養基上，能夠繼代生長，表明其具固氮能力；C16菌株可產生明顯的排油圈，表明該菌株有產生表面活性素的能力。

1.蛋白酶；2.淀粉酶；3.纖維素酶；4.幾丁質酶；5.固氮；6.排油圈

2.4 抑菌譜測定

如表2所示，菌株C16發酵液對馬鈴薯黑痣病菌、小麥根腐病菌、梨黑斑病菌、番茄灰霉病菌、蘋果斑點落葉病菌、小麥赤霉病菌和馬鈴薯枯萎病菌等7種植物病原真菌均有顯著拮抗效果(圖5)，抑菌帶寬度均在6 mm以上(表2)。菌株C16脂肽粗提物對馬鈴薯黑痣病菌、小麥根腐病菌、馬鈴薯干腐病菌、梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌拮抗作用明顯(圖5)，抑菌帶寬度均大于5 mm(表2)，由此可見菌株C16對植物真菌病害的防治具有廣譜性。

1.蘋果斑點落葉病菌；2.馬鈴薯枯萎病菌；3.梨黑斑病菌；4.馬鈴薯干腐病菌；5.番茄灰霉病菌；6.馬鈴薯黑痣病菌；7.小麥根腐病菌；8.小麥赤霉病菌

表2 菌株C16抑菌譜的測定

2.5 菌株C16發酵液和脂肽粗提物對早疫病菌絲的抑制作用

采用生長速率法測定菌株C16不同發酵液濃度對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用。結果顯示抑菌帶寬度隨菌株C16發酵液濃度增加而增加，當發酵液濃度為1×108cfu/mL時，抑菌帶寬度最大，為9.67 mm(圖6)。

隨著菌株C16脂肽粗提物濃度的增加，其對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用增加(圖6)。當濃度為10 mg/mL時，抑菌帶寬度為12.67 mm；當濃度為5 mg/mL時，抑菌帶寬度為12.33 mm。選取5 mg/mL的脂肽粗提物作為后續試驗濃度。

A.發酵液；B.脂肽粗體物

掃描電鏡觀察發現，對照組早疫病菌絲形態表面光滑，分支明顯(圖7-1)。經發酵液和脂肽粗提物處理后的菌絲畸形嚴重，菌絲出現變形扭曲(圖7-2)，局部腫大形成泡囊(圖7-3)，菌絲表面褶皺，胞質外泄(圖7-4)。因此，發酵液對早疫病菌絲有致畸作用，其中脂肽粗提物為發酵液主要活性成分。

1.正常菌絲；2.菌絲變形；3.菌絲囊泡狀畸形；4.菌絲表面褶皺

采用HPLC分析菌株C16脂肽類物質主要成分。菌株C16脂肽粗提物的洗脫峰分離時間為4.59～4.92 min，而純品Iturin和Surfactin的分離時間分別為4.60～4.95和4.59～4.94 min。菌株C16發酵液和純品Iturin和Surfactin的洗脫峰幾乎重疊(圖8)。表明菌株C16發酵液中含有Iturin和Surfactin兩種物質。

圖8 高效液相色譜法(HPLC)對菌株C16脂肽物質的鑒定

采用瓊脂擴散法測定Iturin和Surfactin對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用。如圖9所示，Iturin對馬鈴薯早疫病菌的抑制效果最好；Iturin和Surfactin混合液(體積比1∶1)對馬鈴薯早疫病菌的抑制效果次之；Surfactin對馬鈴薯早疫病菌基本無抑制作用。表明Iturin為貝萊斯芽胞桿菌C16脂肽粗提物中主要抑菌活性成分。

1.表面活性素；2.伊枯草素；3.表面活性素+伊枯草素；4.甲醇；5.無菌水

3 討論

芽胞桿菌在空氣、土壤、水等自然環境中廣泛存在，絕大多數芽胞桿菌對人和環境友好。隨著現代社會中有機農業、生態農業、綠色農產品等各種新興理念的普及，人們對自身健康、環境安全、有害生物綜合治理、農業可持續發展的關注度越來越高。作為一種較為理想的微生物資源，芽胞桿菌在生物防治研究中受到廣泛關注。目前，利用芽胞桿菌防治早疫病已有一些報道。謝梓語等[14]研究發現108cfu/mL枯草芽胞桿菌B1409菌液對茄鏈格孢菌的預防效果和治療效果分別為67.82%和41.22%。白彥麗等[15]發現多粘類芽胞桿菌F-152和Q-28菌液對茄鏈格孢菌的抑菌圈度高達19.95 和17.25 mm。本研究從馬鈴薯根際土壤分離得到貝萊斯芽胞桿菌C16，其菌液對馬鈴薯早疫病菌的抑菌圈為31.5 mm，抑菌活性強，生防能力優良。目前，對早疫病菌生物防治的研究多集中在菌株發酵液對病害的防治效果，然而關于脂肽粗提物對馬鈴薯早疫病菌的拮抗作用，以及相關活性物質的分析鑒定鮮見報道。本研究通過酸沉淀法提取脂肽粗提物，發現10 mg/mL的脂肽粗提物的抑菌帶高達12.67 mm。明確了活性成分，對于今后開發應用該菌株具有重要意義。同時，研究發現的生防菌株具有很強的拮抗作用，表明其在生物防治馬鈴薯早疫病上具有廣闊的應用前景。

抗生作用是芽胞桿菌拮抗植物病原真菌的主要機制之一[16]，芽胞桿菌通過分泌多種次級代謝產物抑制病原微生物的生長，從而達到生防目的[17]。脂肽類物質作為芽胞桿菌重要代謝產物，是生防菌拮抗植物病原真菌的主要活性物質[18]。脂肽類物質可造成菌絲畸形，從而抑制病原菌的生長[19]。趙雅等[20]采用酸沉淀法分離得到HN-Q-8菌株的甲醇粗提取物可以明顯抑制馬鈴薯黑痣病菌的生長，使菌絲產生形態畸形扭曲，頂端彎曲等現象；王雨等[21]發現貝萊斯芽胞桿菌HN-2脂肽粗提物可以造成杧果炭疽病菌菌絲扭曲，末端膨大，對杧果果實具有較好的保護作用。本研究采用酸沉淀法對C16發酵液進行分離提取，得到脂肽粗提物，對馬鈴薯早疫病菌絲有明顯致畸作用，可使菌絲表面褶皺，變形扭曲，局部腫大形成泡囊結構，這在一定程度上揭示了芽胞桿菌對馬鈴薯早疫病菌的拮抗機理。

芽胞桿菌分泌的脂肽類抗生素主要包括Iturin、Fengycin和Surfactin[22]，其生防功能已有報道。Iturins能抑制微菌核的萌發，誘導氧化、應激和絲裂原活化蛋白激酶的激活等，并介導植物的防御反應[23]；Fengycin主要拮抗絲狀真菌，影響真菌細胞膜的表面張力，導致微孔形成，最終破壞細胞膜結構[24]；Surfactin能夠插入到脂質雙層，溶解流動的磷脂相，改變膜的滲透性[25]。本研究利用HPLC對脂肽粗提物中活性成分進行檢測，根據保留時間可初步確定Surfactin和Iturin為C16脂肽粗提物中主要物質。通過瓊脂擴散法分析兩種物質對馬鈴薯早疫病菌的抑菌活性，結果表明Iturin對馬鈴薯早疫病菌有較強的抑菌活性。如需確定其化學結構，還需通過利用高效液相色譜或質譜等手段對Iturin進一步純化及鑒定。

本研究分離得到的貝萊斯芽胞桿菌 C16 在馬鈴薯早疫病生物防治中具有開發利用潛力，但有關其生防機制和抑菌機理尚需進一步研究。