促生菌接種對青稞根際土壤微生物群落結構的影響

姚有華，王玉林，姚曉華，白羿雄，安立昆，李 新，吳昆侖*

(1.省部共建青棵和秏牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室/西藏自治區農牧科學院，西藏 拉薩 850002；2.青海大學農林科學院/青海省農林科學院，青海西寧 810016；3.青海省青稞遺傳育種重點實驗室，青海 西寧 810016；4.國家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016)

【研究意義】微生物肥料可以在保證養分被充分利用的同時可兼顧環境不被污染，它具有增進土壤肥力、制造和協助農作物吸收營養、增強植物抗病和抗旱能力、減少化肥使用量的作用[1]，青藏高原是我國重要的生態安全屏障，其中青海高原被譽為中華水塔，在全國具有重要的生態安全戰略地位，環境保護的重要性不言而喻，在青藏高原農業生產中使用微生物肥料是實施環境保護戰略的有效手段。【前人研究進展】根際促生菌作為有益細菌，定殖在根際土壤中，可促進植物生長進而減少化肥施用[2-3]。根際促生菌通過其菌株具有的溶磷、分泌鐵載體、生物固氮、吲哚乙酸和解鉀等特征對植物產生促生作用[4]。大量研究表明，促生菌菌株的定殖可導致根際土壤有益菌群數量的增加[5]，并可以活化土壤微生物功能菌群的活性而增加菌群數，從而通過減輕或抑制病害發生和產生植物激素或者促生作用促進植物生長[6]。近年來，通過接種促生菌來調節作物根際微生物群落結構和菌群多樣性，進而達到促生作物生長的目的成為國內外相關學者研究的熱點領域，認為通過促生菌接種，可明顯改變植物根際細、真菌群落結構和菌群多樣性，顯著增加有益微生物的豐度，從而促進植物的生長發育[5-6]。目前，微生物菌肥研究備受關注，學者們已從不同作物中分離篩選出促生菌株，已應用于工廠化菌肥生產并供農業生產利用[7-11]。而本研究前期分離篩選到的芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)2株菌株未見是否具有促生效應的報道。【本研究切入點】土壤微生物是農業生態系統中重要的組成部分，而促生菌對青稞根際土壤微生物群落結構的影響的相關研究相對匱乏，因此本研究利用前期篩選出的2株促生芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)菌株進行浸種處理，于青稞灌漿期采集根際土壤樣品，采用MiSeq高通量測序技術，探討促生菌浸種對青稞根際土壤微生物群落結構和菌群多樣性的影響。【擬解決的關鍵問題】揭示促生菌接種對青稞灌漿期根際土壤微生物群落結構的影響，探討促生菌接種對功能微生物菌群多樣性的影響，從根際土壤微生物生態系統的角度解析促生菌對青稞的促生效應，為促生菌肥在青稞生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 于2016年7月，在青海省香日德農場(海拔2950 m，97°22′741″E、37°22′757″N)青稞高產創建試驗田中采集健康青稞植株，帶回實驗室并從中分離篩選出2株促生菌TSXJ4和GSXJA，分子鑒定分別為芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)。

1.1.2 培養基 PDA培養基、牛肉膏蛋白胨固體培養基、馬鈴薯液體培養基。

1.2 試驗地概況

試驗于2017年4月至8月，在青海省西寧市二十里鋪鎮農林科學院種質資源創新試驗基地進行。該地屬青海省東部湟水河流域灌區，36°62′N，101°77′E，海拔2309.00 m。土壤類型為栗鈣土，容重1.50 g/cm3，田間持水率15.20%，耕層有機質含量22.49 g/kg，全氮含量1.78 g/kg，速效磷含量37.48 mg/kg。2017年青稞生育期內(4-8月)降雨量為321.7 mm，平均氣溫分別為14.3 ℃，試驗期內無極端天氣出現(圖1)。

圖1 2017年青稞生育期月降雨量和月平均氣溫

1.3 田間試驗設計

采用完全隨機區組設計，小區面積60 m2(行長3 m，行距20 cm，每小區10行)，3個接種處理各設3次重復，共9個小區，各小區間設置50 cm間距。于2017年4月上旬，取接種和未接種青稞種子，每小區每行人工開溝均勻點播40粒，覆土后輕度鎮壓，田間管理同試驗區一般大田。于青稞灌漿期，取各處理1.5 g根際土壤，置于-20 ℃冰箱保藏，用于微生物群落結構分析。

1.4 試驗方法

1.4.1 促生菌液的制備 用接種環分別挑取促生菌TSXJ4、GSXJA菌苔，接種至已滅菌的PDA培養基和牛肉膏蛋白胨平板培養基，并置于28 ℃恒溫培養箱中18～24 h進行菌株活化[12]。取TSXJ4菌株將其接種于馬鈴薯液體培養基，恒溫振蕩48 h 后用無菌水調節其濃度至106個/mL[12]。取對數期生長旺盛且斜面培養的GSXJA，使用無菌水沖洗斜面上孢子將孢子濃度調節為106個/mL[13]。

1.4.2 接種處理 取 5% NaClO 對青稞種子進行表面消毒并使用滅菌水淋洗 3 次。用濃度為106個/mL TSXJ4與GSXJA菌液浸種10 h(測試組)，用未接種PDA發酵液浸種10 h(CK)。

1.4.3 樣品的預處理 稱取樣品200 mg，置于2 mL已滅菌離心管，加入70%乙醇1 mL，室溫10 000 r/min離心3 min，后加入1×PBS溶液，室溫10 000 r/min離心3 min，以上離心完后均棄置上層液體[14]。

1.4.4 土壤微生物基因組DNA的提取 細菌與真菌總DNA提取均利用試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA)。

1.4.5 土壤細菌16srDNA與真菌18srDNA 測序 對基因組DNA利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒進行精確定量，以確定PCR反應DNA加入的量[14]。Miseq測序平臺V3～V4通用引物(341F/805R)已被16s rDNAPCR所用的引物融合[15]，真菌18s rDNA PCR采用 NS1-FUNG通用引物NS1和FUNGAL。PCR反應體系和擴增條件參照戴瑞卿[14]、王秀紅[15]等的方法。由上海生工生物工程有限公司進行混合樣品后續的樣品建庫與測序。

1.4.6 稀疏性曲線 預處理后的序列中的非擴增區域序列使用Usearch軟件去除，然后進行對序列的測序錯誤矯正，調用uchime軟件進行鑒定嵌合體序列，用Mothur 軟件以97%為劃定閾值做rarefaction分析，利用R制作稀釋曲線[16]。

1.4.7 OTU分布韋恩圖 樣本中共有和獨有的OTU的數目，利用VennDiagram package軟件統計，得出韋恩圖可直觀展現樣品的OTU數目組成相似性及重疊情況[17]。

1.4.8 基于OTU豐度的樣本聚類圖 利用VennDiagram package軟件，層次聚類(Hierarchical cluatering)分析根據beta多樣性距離矩陣進行[15]，樣本聚類樹圖使用非加權組平均法UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構建[17]。

1.4.9 多樣性指數分析 利用mothur 軟件計算樣品包括Chao1 指數和Shannon 指數的α多樣性值[18]，Chao1指數值的高、低表示群落物種的豐富度高、低[18]；Shannon指數值的高、低表示群落多樣性的高、低。

Chao1 豐富度指數：

其中，Schao1為估計OTU數，Sobs表示實際觀測OTU數，n1和n2分別表示只含有1條序列和2條序列的OTU數目。

Shannon 多樣性指數：

其中，Sobs為實際觀測OTU數，ni表示第i個OTU包含序列數，N表示序列總數。

1.4.10 群落結構組分圖 將OTU序列利用blastn軟件與對應數據庫進行比對，篩選出OTU序列最佳比對結果并進行過濾，滿足相似度>90%、coverage>90%的序列進行后續分類，將不滿足條件的序列歸為unclassified[19]。各分類層級水平上樣品的群落組成，參照分類學結果進行統計，群落結構組分圖可利用R軟件對物種分類學統計結果進行作圖得到[14]。

1.5 統計分析

試驗數據采用SPSS 18.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物 DNA 的提取及純度檢測

采集各處理根際土壤樣本，微生物總 DNA使用試劑盒方法提取后經 1%凝膠電泳檢測，由圖2可見，DNA提取條帶15kb以上，高亮度且無拖尾；由表1可知，3個樣品的DNA含量和純度較好，OD260/OD280值介于1.8～2.0之間，不存在RNA或者雜質污染。

表1 DNA 濃度與純度

圖2 土壤DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 土壤微生物PCR 擴增

圖3～4 是對土壤總 DNA 中的細菌(V3～V4區段)和真菌(NS1-FUNGPCR)擴增后的結果，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過與基準條帶對比發現，細菌擴增條帶在500 bp左右，真菌擴增條帶均在600 bp以上，表明可以進行高通量測序。

圖3 PCR 擴增的細菌 V3～V4片段圖

圖4 PCR 擴增的真菌NS1-FUNG片段

2.3 稀疏性曲線

從 圖5～6可知，參試樣品稀釋曲線均表現出平坦，這就說明所取的樣品準確、合理，細、真菌群落結構具有較高的置信度，能夠較真實反映細、真菌群落。

圖5 根際土壤真菌的Shannon 指數稀釋曲線

圖6 根際土壤細菌的Shannon 指數稀釋曲線

2.4 測序數據

通過對細菌TSXJ4 V3～V4區段測序發現，參試樣本的原始序列條數為132020，有效序列總數為128173；通過對真菌GSXJ4 NS1-FUNGPCRNS1-FUNGPCR區段測序發現，參試樣本原始序列條數為 158 279，有效序列總數為158 185。通過對原始序列去冗余處理和聚類，得出在不同 OTU(Operational Taxonomic Units，操作分類單元)中參試樣品的豐度信息，3個樣品V3～V4區段共產生19 474個 OTU，NS1-FUNGPCR區段共產生3346個 OUT，每個樣品的有效序列數量和 OTU 數量。從表2可以看出，V3～V4區段 QC后的序列長度都集中在400～421 bp；NS1-FUNGPCR區段QC后的序列長度都集中310 bp之間左右，QC后的序列長度可以進行微生物鑒定。

表2 各樣本數據信息統計

2.5 聚類分析

從圖7～8可知，樹枝的長度代表樣本間的距離，越相似的樣本會越靠近，圖中CK組與樣品組樹枝長度明顯不同，表明CK組與樣品組OUT豐度存在明顯差異。從圖9～10可以看出，細菌群落結構中GSXJ4與CK組特異OTU數為65.8%，TSXJ4與CK組特異OTU數為64.1%，真菌群落結構中GSXJ4與CK組特異OTU數為74.3%，TSXJ4與CK組特異OTU數為74.0%，表明兩株菌都不同程度的改變了根際土壤中的細菌及真菌群落結構，且真菌群落結構的變化更為明顯。

圖7 根際土壤細菌的樣本聚類圖

圖8 根際土壤真菌的樣本聚類圖

圖9 根際土壤細菌 OTUs 韋恩圖圖

2.6 根際土壤微生物多樣性

由表3 可以看出，根際土壤的細菌豐富度和多樣性均表現為GSXJ4>TSXJ4>CK，真菌豐富度和多樣性結果相反。這說明經促生菌浸種的青稞根際土壤中的細菌多樣性顯著增加，物種豐富度較高；而真菌多樣性則顯著降低，群落結構相對簡單。

表3 土壤樣品多樣性指數分析

2.7 群落結構分析

在綱的分類水平上，青稞根際土壤細菌分為 50個類群，在CK組Alphaproteobacteria(占15.17%)、Gammaproteobacteria(占10.49%)、Sphingobacteriia(占9.51%)、Betaproteobacteria(占8.06%)為優勢菌群，其他菌類比例相對較低。在GSXJ4中，Alphaproteobacteria(占15.21%)、Gammaproteobacteria(占9.01%)、Actinobacteria、(占8.45%)、Betaproteobacteria(占7.6%)為優勢菌群，在TSXJ4中，Alphaproteobacteria(占15.04%)，Gammaproteobacteria(占10.96%)，Actinobacteria(占9.09%)，Betaproteobacteria(占7.37%)為優勢菌群，其他菌類比例相對較低(圖11)。青稞根際土壤真菌分為30個類群，在CK組Schizosaccharomycetes(占29.1%)、Sordariomycetes(占20.33%)、Agaricomycetes(占12.04%)為優勢菌群，其他菌類比例相對較低。在GSXJ4中Schizosaccharomycetes(占33.9%)，Sordariomycetes(占14.31%)，Pezizomycetes(占17.77%)為優勢菌群，在TSXJ4中Schizosaccharomycetes(占26.48%)，Sordariomycetes(占17.48%)，Pezizomycetes(占11.52%)為優勢菌群，其他菌類比例相對較低(圖12)。表明，經過GSXJ4與TSXJ4兩種菌浸種的青稞根際土壤菌群發生了明顯改變，在細菌群落中影響較大的為Actinobacteria及Sphingobacteriia，通過浸種處理，Actinobacteria數量明顯上升，由CK組的5.66%上升為8.45%及9.09%，數量增加了49.3%及60.6%，而Sphingobacteriia數量明顯下降，由CK組9.51%下降為4.71%及5.03%，數量減少50.5%及47.1%。在真菌群落中影響較大的為Agaricomycetes及Pezizomycetes，經浸種處理，Agaricomycetes數量明顯下降，由CK組12.04%下降為4.12%及9.21%，數量減少65.8%及23.5%，而Pezizomycetes，數量明顯上升，由CK組3.48%上升為17.77%及11.52%，數量增加410.63%及231.03%以上。從上述結果可以看出，促生菌對青稞根際微生物的影響中，放線菌綱微生物反應較為敏感，真菌各菌群數目發生較大波動。而放線菌綱微生物是土壤中的主要類群，也是抑制土壤病害，促進土壤養分循環的有益菌群。

圖10 根際土壤真菌 OTUs韋恩

從屬的分類水平上看，經促生菌浸種處理后，細菌種群多樣性增加，但優勢菌群種類及數量較穩定，真菌種類變化較細菌明顯，從圖13～14可以看出，Lecythophora與Rhizoctonia數量明顯下降，而Plicaria數量明顯上升。Rhizoctonia是引起水稻紋枯病的主要致病菌，所以促生菌浸種處理可以抑制植株病原菌，提高植物的抗病性。

圖13 根際土壤細菌genus水平群落結構組分圖

3 討 論

根際土壤是植物進行營養吸收最直接的場所，根際微生物總數量的多少與土壤肥力存在正相關關系，所以微生物種類的多樣性是維持土壤健康及監測土壤質量變化的重要指標[20]。所以研究不同促生菌浸種栽培下，植物根際微生物數量的變化規律，對于探索植物對土壤的作用過程和促生機理具有重要作用。

王西洋[21]研究顯示，外施微生物菌劑對微生物數量及群落結構都有顯著影響。土壤微生物Chao1 指數和 Shannon 指數是表征群落多樣性的常用指數，可以揭示土壤微生物種類和功能的差異[21-22]。Shannon 指數是群落生物多樣性的度量指標，一般來講，指數越高，微生物種類越豐富，營養結夠復雜，穩定性相對較高。在本實驗中，促生菌浸種栽培下，青稞植株根際細菌豐富度和多樣性明顯高于對照，這在一定程度上反映出促生菌浸種使得青稞根際土壤微生物群落結構穩定性提高。

圖14 根際土壤真菌genus水平群落結構組分圖

土壤微生物以細菌為最多，種類豐富，所以生物量也高；土壤中放線菌的數量也很大，僅次于細菌，但生物量并不低于細菌，是主要的抗生素分泌菌，在抑制有害病原微生物生長方面有重要作用；真菌在數量上要比細菌和放線菌要少，在不同的環境中數量變化比較大[22]，真菌可分解土壤中眾多微生物所不能分解的物質，具有很強的分解能力，對提高耕地肥力和改善土壤物理結構作用顯著。細菌/真菌是表征土壤肥力的一個潛在指標[23]，本研究中，促生菌浸種的青稞植株，根際土壤細菌多樣性提高，而真菌多樣性降低，表明根際土壤肥力提升，其可能原因是促生菌影響了根系化感物質的分泌，這些化學物質在根際土壤中不斷積累，原有的微生態環境改變，導致各類微生物的相對數量和比例發生變化，最終導致多樣性指數的變化。在這些變化中，細菌種群的多樣性明顯增加，但優勢菌群相對穩定，真菌數量及種類的變化較細菌明顯，Lecythophora、Rhizoctonia、Plicaria都發生了變化，由此可以推論，促生菌在植物定殖后，可以改善土壤環境微生態，增加土壤肥力。而且本研究結果表明，促生菌對青稞根際微生物的影響中，放線菌綱微生物反應較為敏感，而放線菌綱微生物是土壤中的主要類群，也是抑制土壤病害，促進土壤養分循環的有益菌群。

4 結 論

促生菌浸種栽培改變了根際土壤中的細菌及真菌群落結構，且真菌群落結構的變化更為明顯；促生菌浸種提高了青稞根際土壤中細菌的豐富度和多樣性，而降低了真菌的豐富度和多樣性；青稞根際土壤放線菌綱微生物反應對促生菌浸種較為敏感，且真菌各菌群數目變化波動較大；促生菌浸種使青稞根際土壤細菌種群多樣性增加，但優勢菌群種類及數量較穩定，且真菌種類變化較細菌明顯。