鎘脅迫處理對水培苦苣幼苗生理響應及葉片超微結構的影響

朱潤華，賀忠群，王海霞，白 勝，陽圣瑩，蔣浩宏

(1.四川省農業科學院服務中心,四川 成都 610066;2.四川農業大學 園藝學院,四川 成都 611130)

【研究意義】近年來，日益嚴重的重金屬污染問題亟待解決，其中鎘(Cd)因其高污染和可遷移性，越來越受到關注,同時鎘對多數有機體有毒害作用，并會隨著食物鏈進入人體，危害人類健康[1-2]。【前人研究進展】金利堅等[3]抽取的四川省21個市州993分樣品中，土壤鎘含量超標樣品占56.90%。當植物在受到高質量濃度鎘脅迫后，會出現生長抑制，株高、鮮重下降、葉片萎黃等現象，同時細胞質膜的組分、結構及選擇透性也受到影響，導致植物細胞損傷并影響其生理代謝，嚴重時造成植物死亡[4-6]。【本研究切入點】苦苣(CichoriumendiviaL.)是菊科一二年生草本植物，又名苦菊、苦菜，其資源分布較為廣泛[7-9]，是人們喜食的鮮食蔬菜。但目前缺乏關于苦苣鎘脅迫的生理過程研究，其對重金屬的耐受差異性也缺乏研究支持。水培技術是無土栽培技術中應用較為廣泛的一種，采用水培方法生產苦苣，可以有效地了解和調控苦苣的生長環境，也可以更好的了解各種元素對于苦苣生長的影響。【擬解決的關鍵問題】苦苣在已知的生產栽培中表現出了較強的適應性，研究鎘脅迫條件下苦苣的生長及生理特性的變化，以及鎘脅迫下水培苦苣葉片的超顯微結構變化，可為以后苦苣的推廣種植以及重金屬積累研究等方面提供參考建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的植物材料為花葉苦苣(CichoriumendiviaL.)，由北京東升種業有限公司提供。

在原霍格蘭氏營養液基礎上進行調整，其中A母液含四水硝酸鈣70.8 g/L、硝酸鉀80.8 g/L；B母液含磷酸氫二銨15.4 g/L、七水硫酸鎂49.2 g/L；C母液含EDTA鐵鈉鹽50 g/L、硼酸4.26 g/L、四水硫酸錳5.72 g/L、七水硫酸鋅0.44 g/L、五水硫酸銅0.16 g/L、四水鉬酸銨0.04 g/L。水培苦苣每3 d補充1次營養液，每次0.5 L。

1.2 試驗方法

試驗2020年3月至4月在四川省農業科學院服務中心農業工程研究中心植物工廠內進行，采取半封閉管理。光源采用三基色熒光燈，光譜如圖1所示。每天光照12 h(7:00-19:00)室內，溫度20 ℃。 苦苣種子在催芽箱中露白出芽后，定植于水培槽(規格為40 cm×30 cm×5 cm)中，每個水培槽中種植120株苦苣幼苗，如未成功定植及時補苗。

圖1 植物工廠人工光源光譜

所有幼苗出現5片真葉后進行鎘脅迫。在水培槽中添加含有不同濃度氯化鎘的營養液0.5 L。營養液濃度分別設置為0 mg/L氯化鎘(CK)，0.5 mg/L氯化鎘(A1)，1 mg/L氯化鎘(A2)，5 mg/L氯化鎘(A3)，10 mg/L氯化鎘(A4)。A1為低濃度鎘處理，A4為鎘高濃度處理。每個處理3次重復,共15個水培槽。到30 d時添加的營養液不再含氯化鎘。

1.3 指標測定

在處理30 d時進行生長指標的測定:株高、地上部分鮮重，水培苦苣幼苗致死率(%)=死亡株數/總株數×100%[10],均取平均值。

鎘脅迫3 d時測定地上部分鎘含量[11]；葉片丙二醛(MDA)測定參考熊慶娥[12]的方法；游離脯氨酸測定采用酸性茚三酮比色法；SOD活性測定參考李合生[13]的方法；POD性測定參考王學奎[14]的方法；葉綠素含量測定參考LICHTENT-HALER等[15]的方法。

1.4 葉片超微結構的觀察

處理3 d時，將地上部分嫩葉送四川大學電鏡室用透射電鏡觀察其超微結構變化。

1.5 數據分析

用Excel對試驗數據進行統計分析，用SPSS 軟件(新復極差法)對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫處理對水培苦苣鎘積累的影響

由表1可知，鎘脅迫3 d時，A4處理苦苣鎘含量超過國家食品安全標準[16]，CK處理的鎘含量小于或等于國家標準限定量，故未標注具體數值。

表1 鎘脅迫3 d時苦苣幼苗的總鎘含量

2.2 鎘脅迫對水培苦苣幼苗生長的影響

2.2.1 鎘脅迫對苦苣幼苗致死率、地上部分鮮重和株高的影響 鎘處理使苦苣幼苗的死亡率顯著提高(表2)隨著營養液中鎘濃度增高，處理30 d時苦苣幼苗死亡率也隨之升高。與對照相比，A1和A4處理的苦苣幼苗死亡率分別提高了166.80%和933.20%。

表2 鎘脅迫對苦苣幼苗死亡率、鮮重和株高的影響

鎘脅迫30 d時，處理組與CK組相比，苦苣幼苗地上部分鮮重和株高顯著降低。隨著營養液中鎘濃度的增加，苦苣幼苗地上部分的鮮重和株高均呈現下降趨勢。與CK相比，A4處理苦苣幼苗地上部分平均鮮重下降35.55%，株高下降22.19%。

2.3 鎘脅迫對水培苦苣幼苗葉綠素及類胡蘿卜素的影響

隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片內的葉綠素a、

葉綠素b、總葉綠素含量均表現為先升高后下降的變化趨勢(表3)。A3處理苦苣幼苗葉片總葉綠素含量最大，與CK相比，A3處理葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量分別提高26.15%、26.27%和26.18%。A4處理與A3處理相比，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量分別下降5.24%、4.55%和4.97%。類胡蘿卜素含量隨著營養液中鎘濃度增大表現出逐漸升高的變化趨勢，A4處理苦苣幼苗葉片類胡蘿卜素含量含量達到最大值，相比CK處理提高23.36%。所有處理水培苦苣幼苗的類胡蘿卜素的含量均遠高于總葉綠素含量。

表3 鎘脅迫對苦苣幼苗葉片總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b含量及類胡蘿卜素的影響

2.4 鎘脅迫對苦苣幼苗游離脯氨酸含量和丙二醛的影響

隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片游離脯氨酸含量總體表現為先升高后降低的變化趨勢(表4)。與CK相比，A1處理的脯氨酸含量顯著提高，升高25.45%，A4處理比A1處理苦苣幼苗體內游離脯氨酸含量下降19.42%，但還是略高于CK處理。隨著鎘濃度升高，苦苣幼苗葉片丙二醛(MDA)含量總體表現為先升高后降低的趨勢。與CK相比，A1處理的丙二醛含量顯著增加，相比CK提升14.00%，而含量最低為A4處理，較A1處理苦苣幼苗體內游離脯氨酸含量下降11.25%。

表4 鎘脅迫對苦苣幼苗葉片游離脯氨酸和丙二醛含量的影響

2.5 鎘脅迫對葉片超氧化歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶POD的影響

隨著鎘濃度升高，鎘處理使苦苣幼苗葉片內的SOD活性呈現逐漸下降的趨勢(表5)，A1、A2、A3、A4處理中SOD活性相比于CK處理顯著下降，下降幅度分別為53.08%、57.25%、78.66%和88.61%。A1和A2處理與CK相比，SOD活性表現為降低，但兩組處理間沒有顯著性差異。處理A3和A4的SOD活性下降幅度與營養液氯化鎘濃度表現為負相關性。苦苣幼苗葉片內的POD活性也呈現先下降后上升的趨勢，處理A1相比CK處理下降3.10%，A2處理POD活性最低，比CK降低11%，POD活性最高為A4處理，較CK升高27%。

表5 鎘脅迫對苦苣幼苗葉片超氧化歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性含量的影響

2.6 鎘脅迫對水培苦苣幼苗葉片超微結構的影響

2.6.1 鎘脅迫對苦苣幼苗葉綠體形態及分布的影響 CK處理苦苣幼苗的葉綠體與細胞膜貼合均勻緊密(圖2)，葉綠體形態狹長扁平，內外膜結構完整，有利于最大程度接受光能；隨著鎘處理濃度增加，葉片內的葉綠體與細胞膜之間緊貼程度下降，逐漸脫離細胞膜或與細胞膜貼合出現空隙，在細胞質中扎堆分布，葉綠體形態發生不同程度的腫脹，且隨著總鎘含量增加，葉綠體腫脹變形程度也逐漸增加。

a：葉綠體；b：基粒片層；c：淀粉粒；d：嗜鋨顆粒

2.6.2 鎘脅迫對苦苣幼苗葉綠體內淀粉粒的影響 CK處理苦苣幼苗葉片的葉綠體內淀粉粒體積較小且含量較少，多數葉綠體內觀察不到淀粉粒；隨著營養液中氯化鎘濃度的增加，從A1處理開始，苦苣幼苗葉片的葉綠體內淀粉粒數量增加，但體積依舊較小；在A2和A3處理中，苦苣幼苗葉片的葉綠體內的淀粉粒迅速增大，在葉綠體中占據較大體積；與CK處理與A1處理相比，A4處理苦苣幼苗葉片幾乎所有葉綠體均含有淀粉粒，葉片葉綠體中淀粉粒大量增加且體積較大。

2.6.3 鎘脅迫對苦苣幼苗葉綠體內嗜鋨顆粒的影響 CK、A1、A2處理下，苦苣幼苗葉綠體內的嗜鋨顆粒體積都相對較小，數量也較少；A3處理中苦苣幼苗葉綠體內的嗜鋨顆粒數量相對較少，但與其他處理相比體積明顯增大；A4處理中，嗜鋨顆粒體積較小，數量較適中。

2.6.4 鎘脅迫對苦苣幼苗基粒的影響 在CK、A1處理中生長的苦苣幼苗，葉綠體內部基粒和基質類囊體排列較為有序，片層結構規則，沒有出現明顯變形，片層之間也未出現明顯間隙。隨著苦苣幼苗體內總鎘含量的增加，苦苣幼苗葉綠體基粒片層之間出現了明顯的間隙，基粒垛疊結構變得模糊，片層發生斷裂，部分類囊體膜糊不清，類囊體之間出現扭曲或者膨脹，在A4處理中最為明顯。

3 討 論

葉綠素是光合作用中最重要的色素，在接受、傳遞、轉化光能上發揮著不可替代的作用，其含量的高低與光合作用密切相關[17]。本研究結果顯示，鎘脅迫下葉綠素含量整體表現為先升高后降低的變化趨勢，可能是因為低濃度鎘刺激葉綠素合成，進而維持光合作用，而隨著苦苣幼苗體內總鎘含量的增加，脅迫程度超過葉綠素合成速度的極限，同時產生了大量的活性氧自由基，對葉綠素被膜產生過氧化作用，導致葉綠素降解。

類胡蘿卜素是主要位于光合與非光合植物質體中的脂溶性抗氧化劑[18]，可以清除植物體內的自由基，防止膜脂質過氧化，穩定膜脂質雙分子層[19]。類胡蘿卜素也是構成植物葉、花和果實顏色的重要成分之一[20]。本研究發現，隨著苦苣幼苗體內總鎘含量的增加，類胡蘿卜素含量趨勢表現為逐漸增加。在植物體內，類胡蘿卜素能夠防止光氧化產生的破壞作用并協助葉綠素吸收光能，但正常情況下葉片中葉綠素含量均高于類胡蘿卜素含量，本試驗中類胡蘿卜素含量卻遠高于葉綠素，可能由以下三個原因導致：一是由于苦苣幼苗通過增加類胡蘿卜素含量加強清除活性氧的能力；二是由于類胡蘿卜素組成復雜，對鎘的敏感程度小于葉綠素，與朱喜鋒等[21]的研究結果一致，Cd2+通過損害光合作用器官、結合生物大分子的活性位點(如Cd2+取代葉綠素分子中心的Mg2+從而破壞葉綠素結構)影響光合作用；三是由于植物工廠人工光源的光照強度過高，類胡蘿卜素基于調節吸收過剩光能的作用，植物自身適應性調節，進而積累了較多的類胡蘿卜素。

植物的質膜透性變化和滲透調節相關研究在植物逆境反應研究中較為普遍。本研究表明，鎘脅迫對苦苣幼苗滲透作用相關調節物質和質膜透性變化的影響是基本一致的。游離脯氨酸作為重要滲透保護劑，在各個生理逆境中均表現了游離脯氨酸的積累[22]。其主要作用在于保持細胞內外水分平衡、調節細胞內外滲透勢，對維持細胞內相關代謝功能的正常進行具有重要意義[23]。丙二醛(MDA)是植物遭受逆境脅迫程度高低的重要指標[24]，其含量的變化可以反映出質膜透性變化所導致的電解質外滲，了解細胞膜脂的過氧化程度。在低濃度鎘脅迫時，苦苣幼苗自身的滲透調節和質膜透性就開始產生變化，游離脯氨酸含量與丙二醛含量整體均表現為先上升后下降的趨勢。隨著鎘濃度增加，脅迫程度超過苦苣幼苗自身調節作用的極限，相關滲透調解物質含量下降，進而對植物細胞造成傷害。

重金屬離子對植物地上部分的影響也存在于呼吸作用中，楊樹華等[25]研究表明，水稻種子萌發時的呼吸強度隨鉛離子濃度增加而降低，呈顯著負相關性。低濃度鎘刺激植物呼吸酶以產生能量是呼吸增加的原因，隨鎘濃度增加酶活性受抑制呼吸作用下降[26]。當植物遭遇逆境脅迫時，體內自由基(ROS)、活性氧積累量提升，抗氧化酶活性在自身調節作用下也會相應提高。但本試驗中，隨著營養液中添加氯化鎘溶液濃度的增加，苦苣幼苗內SOD酶活性表現為逐漸降低。在A1處理下，低濃度鎘造成的脅迫程度較輕，而SOD酶活性相較于空白組依舊下降了53%，可能是由于鎘直接作用在SOD酶合成的代謝通路上，進而降低了苦苣幼苗體內SOD酶的活性。SOD酶可以將自由基、活性氧轉化為無害的水與氧氣，進而間接降低重金屬離子對植株的傷害，本試驗中水培苦苣幼苗在吸收鎘后，無法正常清除自由基、活性氧等超氧陰離子，進而也間接解釋了30 d時高濃度鎘溶液處理導致苦苣幼苗的高致死率和在處理3 d時幼苗體內總鎘含量累積較快的原因。

SOD等抗氧化關鍵酶在清除調節植株體內的活性氧，抵御、減輕活性氧造成的傷害上起重要作用。SOD能夠將超氧陰離子歧化為過氧化氫(H2O2)，緩解超氧陰離子對植株的毒害作用[27]，POD能夠清除不同細胞位置的H2O2，使之轉化為H2O[28]。POD酶活性的變化沒有SOD劇烈,且表現為先下降后上升的趨勢，在A2處理到達最低值，說明苦苣幼苗在受到鎘脅迫時，有些抗氧化酶活性受到抑制，但整個酶保護系統還是起到了一定緩解自由基危害的作用，使其他酶活性升高，一定程度上緩解了鎘脅迫下活性氧自由基對膜質的損傷，并對植株的正常生長造成了一定的影響。該結果可能是因為鎘雖然影響了氧化酶的合成途徑，但是隨著鎘濃度的增加，對酚類物質的代謝起到了部分刺激作用，才使得POD酶的活性隨之增高。

對苦苣幼苗葉片的超顯微結構進行觀察發現, A1處理中,葉綠體沿細胞膜均勻分布且可以緊貼細胞膜。內部結構較為完整,基粒片層結構規則有序，基質類囊體結構清晰,有利于光能的接收、利用、轉化。隨著鎘脅迫程度的增加,葉綠體分布不再均勻沿著細胞膜,在細胞質中出現部分扎堆聚集的現象。葉綠體外背膜不再光滑清晰,基粒膨脹且排布開始混亂，基粒片層間出現明顯間隙,部分類囊體變得膜糊不清,造成的原因可能是鎘直接破壞葉綠體的膜結構或者細胞質膜，進而造成葉綠體變形失活；鎘脅迫阻礙了淀粉的水解和向外運輸，使得葉綠體內出現較大體積淀粉粒，與孔維萍等[29]研究結果相似；鎘阻礙了葉綠體光合電子傳遞,使光化學活性降低；亦或者是由于無法及時清除活性氧自由基，進而造成葉綠體結構和功能的破壞。隨著苦苣幼苗體內鎘積累量的增加，葉綠體與細胞膜之間的空隙也在增加，說明在較高濃度鎘脅迫下，重金屬離子會越來越多的沉積在細胞膜表面，而植株通過自身調節，使葉綠體脫離細胞膜，進而緩解鎘脅迫對細胞功能帶來的損傷。另外，苦苣幼苗對嗜鋨顆粒不敏感，隨著鎘脅迫程度的增加，嗜鋨顆粒數量的累計與體積大小并沒有相關性變化。

4 結 論

鎘積累對苦苣幼苗植株生長及葉片細胞超微結構均造成了較大影響。在鎘脅迫下，苦苣幼苗通過自身調節葉綠素和類胡蘿卜素的含量，改變質膜透性和滲透調節作用，提高了植株對鎘脅迫的適應性。所以苦苣對鎘具有一定的耐性，但過量的鎘會破壞苦苣的部分酶(超氧化歧化酶、過氧化物酶)活性，引起自身調節功能紊亂和代謝異常。此外，隨著鎘脅迫程度的增加，苦苣幼苗葉綠體結構變化較大、功能遭到破壞，進而影響植株整體的生長。因此，本研究結果對以后更加研究深入地研究重金屬脅迫對苦苣幼苗形態結構、逆境應答的影響具有重要意義。