不同海拔地區4種葉類蔬菜及土壤中滅幼脲的殘留及消解動態分析

代艷娜，潘 虎，劉青海*，楊曉鳳

(1. 西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所， 西藏 拉薩 850032；2. 四川省農業科學院分析測試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】根據中國農業農村部市場預警專家委員會統計分析，2018年我國蔬菜種植面積約2043.89萬hm2，產量約7.035億t，人均占有量為504.14 kg，普通白菜和大白菜等葉類蔬菜是我國播種面積較大、產量較高、種植戶喜植的省工蔬菜品種[1]。葉類蔬菜的大面積種植導致菜青蟲、小菜蛾和甜菜夜蛾等蟲害頻發，造成葉類蔬菜產量和品質的降低[2]。滅幼脲(Chlorbenzuron)是一種苯甲酰脲類昆蟲幾丁質合成抑制劑，該藥可妨礙昆蟲內表皮中幾丁質的沉積和生物合成，抑制昆蟲蛻皮，最終導致幼蟲死亡[3]。目前，該藥主要用于潛葉蛾、菜青蟲、毒蛾類及夜蛾類等鱗翅目害蟲的防治[4]，但其使用量較大、藥效慢、果蔬殘留檢出率較高、對水生甲殼動物和節肢動物毒害較大[5-6]，故其殘留消解動態和生物安全性需持續關注。【前人研究進展】目前，有關滅幼脲在果蔬和土壤中的殘留及消解動態的報道較少，國內僅針對大白菜[7-8]、甘藍[9]、蘋果[10]、桃[11]等少數果蔬開展了相關研究，且上述研究主要集中在北京、上海、山東、湖北等低海拔地區，而尚無西藏等高海拔地區的相關研究報道，滅幼脲在高海拔地區蔬菜上的殘留安全性有待進一步探討。【本研究切入點】農藥的殘留及消解動態與生態環境、氣候有著密切關系[12-13]，西藏自治區拉薩市是地處青藏高原腹地，海拔約3667 m，高寒、缺氧、強日照等特殊的自然環境導致滅幼脲等農藥的殘留及消解動態與四川等溫和、濕潤、多霧的低海拔地區存在較大差異，但目前尚無開展相關研究報道。本文采用UPLC-MS/MS法分析了滅幼脲在西藏自治區拉薩市和四川省彭州市設施蔬菜種植基地的4種葉類蔬菜和土壤中的消解動態及最終殘留量的差異。【擬解決的關鍵問題】以期明確蔬菜品種和不同海拔地區的種植環境對滅幼脲的殘留及消解動態的影響，為將滅幼脲用于高海拔地區葉類蔬菜蟲害的防治提供基礎數據，促進西藏地區蔬菜等凈土健康產業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 供試農藥：20 %滅幼脲懸浮劑(京博農化科技有限公司)。供試作物：四季王大白菜和法國皇后西芹(鳳鳴雅世種業有限公司)，意大利生菜和寒春快菜(昆明市華興種業有限公司)。

1.1.2 試劑和耗材 滅幼脲標準溶液(1000 μg/mL，農業農村部環境環境保護科研監測所)，甲醇、乙腈(進口色譜純，美國Fisher公司)，氯化鈉(分析純，成都市科隆化學品有限公司)，乙酸銨(色譜純，迪馬科技有限公司)，有機系濾膜(0.22 μm，島津技邇上海商貿有限公司)，CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色譜柱 (100 mm×2.0 mm×3 μm，日本資生堂)。

1.2 儀器

美國Waters公司的ACQUITY UPLC H-class超高效液相色譜系統(包括二元梯度泵、真空在線脫氣機、柱溫箱和自動進樣器)，美國AB SCIEX公司的4500 Qtrap三重四級桿串聯質譜儀(配置TurbolonSprap離子源、HARVARD pumpⅡ針泵及安裝Analyst軟件的計算機)，德國BRAUN公司的CombiMax K600型蔬菜粉碎機，德國IKA公司的T18型勻漿機，電子天平(d=0.001 g、上海菁海儀器有限公司)，美國Millipore公司的Milli-Q超純水制備系統。

1.3 試驗設計

2018年3月至2020年3月在西藏自治區拉薩市堆龍德慶區羊達蔬菜種植專業合作社(海拔3667 m)和四川省彭州市濛陽鎮四川農科院植物高技術育種試驗基地(海拔593 m)設施蔬菜基地開展相關殘留試驗，試驗設計參照農業農村部《農作物中農藥殘留試驗準則》[14]和《植物源性農產品中農藥殘留貯藏穩定性試驗準則》[15]。

1.3.1 最終殘留試驗 設3個重復試驗小區，每個小區面積約50 m2，各試驗小區間設保護隔離區，另設清水空白對照區。按照采收期倒推施藥時間，按照滅幼脲570 mL/hm2[114 mL(a.i)/hm2,最大推薦劑量)]的劑量噴霧施藥2次，施藥間隔7 d，于末次施藥后7、14、21 d采集蔬菜整株樣待測。

1.3.2 消解動態試驗 植株。設3個重復試驗小區，每個小區面積約50 m2，各試驗小區間設保護隔離區，另設清水空白對照區。4種葉菜約生長到成熟個體1/2時，按滅幼脲855 mL/hm2[171 mL(a.i)/hm2,最大推薦劑量1.5倍]的劑量均勻噴霧施藥1次，于施藥后2 h，1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d采集整株蔬菜待測。

土壤。選擇在種植地附近的空地中進行，試驗小區面積為 50 m2(分3個重復小區); 施藥劑量855 mL/hm2[171 mL(a.i)/hm2]，施藥后 2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采樣，另設清水對照。

1.3.3 樣品采集、運輸、制備和儲存 植株采樣。隨機采集2份蔬菜樣品，每份樣品不少于12個個體且不少于2 kg。小區邊行和每行距離兩端0.5 m 內不采樣。蔬菜鮮樣2 h內運至實驗室，去除表面泥土和明顯腐壞、萎蔫部位后切段、勻漿，留取約250 g樣品于-20 ℃冷凍保存、備用。

土壤采樣。隨機選取5～10個樣點，用土鉆采集0～10 cm 的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣250 g，于-20 ℃冷凍保存、備用。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品前處理[16]植株。稱取25.00 g(精確至±0.01 g)蔬菜樣品于250 mL燒杯中，加入50 mL乙腈，12 000 r/min高速勻漿2 min，用定量濾紙快速過濾至裝有5～7 g 氯化鈉的具塞試管中，劇烈振蕩1 min，室溫靜置30 min，精確吸取上層乙腈相溶液1 mL，加入1 mL甲醇水溶液(1∶1/v∶v)，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，裝瓶待測。

土壤。稱取10.00 g(精確至±0.01 g)土壤樣品于50 mL離心管中，依次加入10 mL水、20 mL乙腈，渦旋混勻1 min后，超聲提取10 min，放入水浴振蕩器中振蕩30 min，用定量濾紙快速過濾至裝有5～7 g 氯化鈉的具塞試管中，劇烈振蕩1 min，室溫靜置30 min，精確吸取上層乙腈相溶液1 mL，加入1 mL甲醇水溶液(1∶1/v∶v)，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，裝瓶待測。

1.4.2 儀器條件[17]色譜條件：進樣體積3 μl；柱溫40 ℃；流動相A相為含0.1 %甲酸的0.2 mmol/L乙酸銨水溶液，B相為甲醇，流速0.3 mL/min；洗脫梯度程序：A∶B=70∶30(v/v)，2.0 min；A∶B=60∶40(v/v)，5.5 min；A∶B=5∶95(v/v)，6.5 min；A∶B=3∶97(v/v)，9.0 min；A∶B=70∶30(v/v)。質譜條件：采用ESI正離子MRM監測模式，霧化氣流速50.0 L/h，輔助加熱氣流速50.0 L/h，氣簾氣流速30.0 L/h，噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣溫度550 ℃。離子對和碰撞能量參數見表1。

表1 滅幼脲的特征監測離子

1.4.3 標準工作曲線制作和添加回收試驗 標準工作曲線：精確移取0.5 mL的滅幼脲標準溶液(1000 μg/mL)于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到50 mg/L 標準儲備液，再移取1.0 mL的滅幼脲標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到5 mg/L的標準溶液。分別用4種葉菜空白基質和土壤空白基質稀釋標準溶液，得到質量濃度分別為 0.001、0.002、0.005、0.08、0.1、0.2、0.3、0.5和1.0 mg/L的混合標準工作液，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。添加回收試驗：在4種葉菜空白樣品和土壤空白樣品中添加一定量的滅幼脲標準溶液，添加水平為 0.01、0.1 和 0.5 mg/kg，重復5次，按1.4.1 和 1.4.2所述方法進行樣品前處理及上機測定。

2 結果與分析

2.1 基質效應的消除及典型色譜圖

在實際樣品分析中共洗脫基質成分會引起分析信號的抑制或增強，是LC-MS/MS 定量分析中產生誤差的根本原因[18-19]。本試驗采用基質配制標準樣品來補償實際樣品溶液對目標農藥產生的基質效應，在1.4.2液相色譜-質譜條件下未出現雜質干擾峰(圖1)，滅幼脲的響應值較好，能夠確保檢測結果的準確性。

2.2 方法線性范圍和檢出限

標準曲線在0.005～0.5 mg/L范圍內滅幼脲呈現良好的線性關系， 相關系數r為0.9985～0.9996，檢出限為3.34×10-6～2.55×10-5mg/kg，定量限均為0.01 mg/kg，能夠滿足儀器分析相關系數要求(表2)。

表2 滅幼脲在4種葉類蔬菜和土壤中的回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.3 方法準確度和精密度

添加回收試驗結果表明，滅幼脲在小白菜、生菜、大白菜、芹菜和土壤中的回收率分別為82.31 %～117.28 %、77.25 %～117.87 %、84.59 %～111.69 %、87.99 %～117.47 %和82.52 %～113.40 %(表3)。RSD在3.1 %～8.2 %，結果均符合《農作物中農藥殘留試驗準則》要求。當添加濃度0.005 mg/kg

表3 滅幼脲在4種蔬菜和土壤基質中回收率及相對標準偏差(n=5)

續表3 Continued table 3

2.4 消解動態試驗結果

在西藏拉薩市和四川彭州市設施蔬菜基地開展的消解動態試驗結果顯示，兩地4種葉類蔬菜和土壤中滅幼脲的消解動態曲線均呈指數函數關系，滿足一級動力學方程Ct=C0e-kt(圖2)。滅幼脲在高海拔設施蔬菜基地的4種葉菜和土壤中的原始沉積量低于在低海拔設施蔬菜基地的4種葉菜中的原始沉積量(表4)，但滅幼脲在不同海拔地區的4種葉類蔬菜和土壤中的原始沉積量總體上差異性較小，說明農藥原始沉積量跟海拔高度沒有明顯相關性。但同一地區4種葉類蔬菜上滅幼脲的原始沉積量由大到小依次為芹菜、生菜、小白菜和大白菜。半衰期結果顯示，滅幼脲在蔬菜中的半衰期比土壤中半衰期短，且高海拔地區4種葉類蔬菜及其土壤中滅幼脲的半衰期均短于低海拔地區，滅幼脲在4種蔬菜中的半衰期由短到長依次為小白菜、生菜、大白菜、芹菜，其中滅幼脲在拉薩設施基地的芹菜和大白菜中的消解半衰期為7.0和3.4 d，而在彭州設施蔬菜基地的芹菜和大白菜中消解半衰期為11.6和6.2 d，差異較大，可能是由于拉薩地區日照強度大，導致該地區設施蔬菜中的農藥降解速率較快。

表4 滅幼脲在4種作物和土壤中的消解動態及半衰期

2.5 最終殘留試驗結果

最終殘留量與施藥次數和施藥量均有關，農藥殘留量隨著施藥次數和施藥量的增加，殘留量增大。最終殘留試驗結果表明，間隔 7、14、21 d 采集樣品，滅幼脲在4種葉菜中的殘留量分別為 0.160～0.576、0.002～0.284 和 ND～0.175 mg/kg，拉薩市和彭州市小白菜中的滅幼脲殘留量均符合最大殘留限量(MRL)標準[20]，滅幼脲在小白菜菜中的安全風險較小。第2次施藥7 d后，滅幼脲在芹菜中的殘留量最大，在相同施藥條件下，拉薩市4種葉類蔬菜中滅幼脲的殘留情況優于彭州市(表5)。由于我國尚未制定滅幼脲在芹菜、大白菜、生菜中的最大殘留限量值，此次殘留試驗的結果，可以作為制定芹菜、大白菜、生菜中滅幼脲最大殘留限量值數據參考。

表5 滅幼脲在4種葉菜和土壤中的殘留量

3 討 論

本研究建立了UPLC-MS/MS 測定葉類蔬菜及其種植土壤中滅幼脲的消解動態方法，該方法前處理操作簡便，具有較好的精密度、靈敏度和準確度，能夠滿足不同海拔地區滅幼脲的殘留檢測要求。殘留消解動態試驗結果表明，滅幼脲在拉薩市和彭州市的四種葉類蔬菜及其土壤中的消解符合一級動力學方程，滅幼脲的年際間消解動態及最終殘留差異較小，但高、低海拔地區的消解動態及最終殘留差異較大。作物本身對農藥吸附能力和生物稀釋作用影響農藥的降解速率，芹菜對滅幼脲的吸附能力強于其他3種蔬菜，因此滅幼脲在芹菜上的原始沉積量大于其他3種蔬菜，半衰期相對長于其他3種蔬菜。2018 和2019年滅幼脲在拉薩市的4種葉類蔬菜及其土壤中的半衰期和最終殘留量均小于彭州市，其中芹菜、大白菜和土壤中差異尤為顯著，上述結果表明地域環境(溫差、光照等)、土壤類型(有機質、pH、陽離子代換率)等因素對滅幼脲的殘留有著較大影響[21-22]。目前，有關滅幼脲在果蔬和土壤中的殘留及消解動態的報道較少，而尚無西藏等高海拔地區的相關研究報道，農藥降解速率與光照強度有很大關系，畢望富等[8]研究發現低海拔地區滅幼脲在大白菜上半衰期為13.2～14.0 d，在土壤中為8.8～27.0 d。而滅幼脲在高海拔地區在大白菜上的半衰期僅為3.4 d，土壤中11 d，可能是西藏地區光照強度大的原因。因此，根據本文的研究結果，在西藏地區可以適當縮短滅幼脲的安全間隔期。同時，滅幼脲在4種不同葉類蔬菜上的降解半衰期也有較大差異，這可能與不同作物的生長速率、對藥物的吸收性等差異有關[23-24]。本文首次探討了蔬菜品種和不同海拔地區的種植環境對滅幼脲的殘留及消解動態的影響，為將滅幼脲用于高海拔地區葉類蔬菜蟲害的防治提供了詳細的研究數據。

4 結 論

滅幼脲在拉薩市4種葉類蔬菜和土壤中的半衰期均短于彭州市，但其半衰期的長短在不同地區的4種葉類蔬菜中無差異，即小白菜<生菜<大白菜<芹菜。在相同施藥條件下，拉薩市4種葉類蔬菜的滅幼脲殘留情況優于彭州市，高海拔地區較低海拔地區為滅幼脲的殘留低風險區域。