肌營養不良小鼠關鍵基因和通路的生物信息學分析

廖子鈺, 李 歡, 王 倞, 林金福, 張 成

杜興型肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種X-連鎖隱性遺傳性疾病。DMD基因定位于Xp21.2，編碼具有抗牽拉作用的抗肌萎縮蛋白(dystrophin)[1]。患者出生后無明顯癥狀，3～5歲時即出現行走、跑步異常，下蹲起立需扶膝，上樓困難，病程進展迅速，10歲左右不能行走，到20～30歲時死于心功能衰竭[2]。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)小鼠是DMD最常用的動物模型[3]。mdx鼠由于Dmd基因第23號外顯子無義突變，產生截短的、無功能的抗肌萎縮蛋白，導致肌肉收縮過程中肌膜容易受損，從而出現與人類患者相似的肌纖維壞死、細胞浸潤、再生等病理變化[4]。

隨著生物信息學技術的發展，微陣列技術逐漸應用于突變基因檢測和差異表達基因篩查[5～7]，對于研究許多疾病的發病原理、尋找生物標記物和治療靶點有重要意義。

本研究從基因芯片公共數據庫GEO下載了3組mdx鼠基因表達數據，對在以上3個數據集中均為差異表達的基因進行基因本體論分析和富集信號通路分析，篩選出其中起核心作用的關鍵基因，對探索影響DMD發病的分子機制、尋找新的治療靶點具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 基因微陣列數據集的篩選 篩選條件：對照組為未作其他干預處理的C57BL/10野生型小鼠，實驗組為C57BL/10背景的mdx鼠，均為雄性，6～8周齡，取材部位為脛骨前肌或腓腸肌。以“Duchenne muscular dystrophy”和“mdx mouse”為檢索詞檢索GEO DataSets數據庫，獲得3個符合條件的數據集。

1.2 差異表達基因的獲取 在線工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)用于分析以上3組微陣列數據中mdx組小鼠和正常組的差異表達基因。篩選條件為：log2FC≥1或≤-1，即上調或下調的基因表達水平差異倍數(fold change,FC)≥2倍，以調整后P值<0.05為差異有統計學意義。將各數據集得出的差異表達基因輸入venn diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，綜合得出在3個數據集中均存在差異表達的基因。

1.3 差異表達基因本體論(Gene ontology,GO)和KEGG富集信號通路分析 GO分析從生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個方面注釋基因功能。KEGG數據庫用于所富集信號通路分析，即差異表達基因位于某信號通路的基因數量。使用DAVID在線數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對DEGs同時執行GO和KEGG分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 蛋白質-蛋白質互作網絡(proteins-protein interaction,PPI)與關鍵基因分析 使用在線網站STRING(https://string-db.org/,version 11.0)對DEGs構建PPI網絡，然后將網絡數據輸入Cytoscape軟件進行可視化分析。PPI網絡中各DEG的相互作用關系用連接度(connective degree)表示，連接度高的基因是該網絡的重要節點，稱關鍵基因。使用Cytoscape中的CytoHubba插件，根據MCC算法篩選前10位的基因作為關鍵基因。

2 結 果

2.1 差異表達基因的篩選 納入的3個數據集為：GSE7187、GSE52766、GSE64418，均使用了基因微陣列技術進行轉錄組學分析。其中GSE7187篩選出648個DEGs；GSE52766篩選出365個DEGs；GSE64418篩選出285個DEGs。把3組DEGs輸入Venn diagram網站取交集，得出68個共同表達的DEGs(見圖1)。3個數據集的交集68個DEGs即為mdx鼠的特征性基因。各DEG在以上數據集的變化趨勢分別相同，其中61個基因上調，7個基因下調。

圖1 3個mdx鼠數據集的差異表達基因。使用venn diagram網站分析3個mdx鼠數據集中共同的差異表達基因的數量

2.2 差異表達基因的GO功能注釋分析及KEGG通路分析 通過DAVID網站(https://david.ncifcrf.gov/)分析以上68個DEGs的功能與定位。GO分析的結果表明：(1)在生物過程(biological process,BP)方面，DEGs與免疫系統的過程、免疫反應、先天免疫反應、中性粒細胞趨化性、ERK1和ERK2級聯陽性調控等相關；(2)在細胞組分(cellular component,CC)方面，DEGs主要存在于細胞膜、外泌體、細胞外區域；(3)在分子功能(molecular function,MF)方面，DEGs與蛋白質結合、相同蛋白質結合、細胞因子激活、IgG結合等活動相關(P<0.05，見圖2)。KEGG分析結果表明DEGs主要富集于金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、肺結核、哮喘、抗原處理和遞呈排斥等過程(P<0.05，見圖3)。

圖2 差異表達基因的Go功能注釋分析。綠色柱代表BP：生物學過程(biological process)，藍色柱代表CC：細胞組分(cellular component)，紅色柱代表MF：分子功能(molecular function)；縱軸代表富集基因數量

圖3 差異表達基因的KEGG通路分析。該氣泡圖依次展示了P值最小的前20個信號通路，其值越小，顯著程度越大。縱軸對應功能或通路，橫軸對應該通路中的差異基因和通路中所有基因的比值(以Enrichmen-score值表示)。氣泡顏色表示P值大小；氣泡大小表示該通路中差異基因的數目

2.3 DEGs蛋白質-蛋白質相互作用網絡(PPI)和模塊化分析確定關鍵候選基因 經STRING v10網站構建DEGs的蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡，得到的PPI由29個節點、157條互作邊構成(見圖4)。選用Cytoscape的cytoHubba插件確定PPI網絡中的關鍵節點，根據連接度由高到低篩選得到10個關鍵基因，依次為：Tyrobq、Emr1、C1qb、Ly86、C1qc、C1qa、Lyz2、Ms4a6d、Fcer1g和Fcgr3(見表1)。這些關鍵基因對mdx鼠的PPI網絡的穩定性起重要作用。

表1 10個關鍵基因

圖4 可視化分析的PPI網絡。由29個節點、157條互作邊構成。節點顏色表示該DEG變化趨勢，紅色為上調，藍色為下調；互作邊的寬度表示互作關系強度(即combined-score值)

3 討 論

盡管假肥大型肌營養不良癥是一種單基因遺傳疾病，但相同的基因突變類型可以導致顯著不同的臨床表現，如DMD基因外顯子3～7的缺失，有的患兒癥狀重為DMD，有的癥狀輕為BMD[8]。可能的原因為該病進展過程涉及多個基因的差異表達，其表型是多信號通路共同起效的結果。迄今，一些具有單核苷酸多態性的修飾基因，如SPP1、LTBP4、CD40、ACTN3和THBS1，已被證明對假肥大型肌營養不良癥患者的表型產生影響[9]。因此，進一步探究發病過程中患者體內基因表達譜的改變，篩選共同的差異表達基因，闡明核心調控基因和所在的信號通路，有助于提供新的治療靶點。

本研究基于公開數據庫進行基因表達分析，探究DMD疾病發生的分子機制。通過生物信息學方法篩選出DMD模型mdx鼠的關鍵基因，包括：Tyrobq、Emp1、C1qb、C1qc、Ly86、Lyz2、Fcer1g、Fcgr3和Ms4a6d。Tyrobp基因編碼的蛋白是許多細胞表面受體的信號適配器蛋白，在樹突狀細胞、破骨細胞、巨噬細胞和小膠質細胞的信號轉導中發揮重要作用，在阿爾茲海默癥患者的大腦中顯著上調，具有重要調節作用。Tyrobp蛋白是一種免疫系統關鍵調節因子，可與阿爾茨海默氏病(AD)相關免疫受體(TREM2、SIRPβ1、CR3)的胞外域形成復合物[10]，其作用主要為增強小膠質細胞的吞噬活性，促進小膠質細胞清除淀粉樣蛋白-β(Aβ)肽和凋亡的神經元；此外，Tyrobp還通過抑制小膠質細胞介導的細胞因子的產生和分泌，參與抑制炎癥反應[11]。降低TYROBP基因的表達可能通過調節免疫-炎癥反應進而減緩甚至終止阿爾茲海默癥的進展[12]。

C1qA-C1qC-C1qB 3個基因等比例表達的18個亞基構成人類補體蛋白C1q[13]。C1q結合包含IgG和IgM的免疫復合物并激活補體經典途徑，負責清除免疫復合物和侵入病原體[14]；此外，在自身免疫病和中樞神經系統炎癥反應中有預防作用[15]。DMD患者C1QB基因異常表達，與鈣離子大量內流導致肌肉壞死有關[16]。

Emr1又稱Adgre1，屬于粘附G蛋白偶聯受體(ADGRE)的一個亞家族，該基因編碼的F4/80抗原是小鼠單核細胞-巨噬細胞標記物[17]，在CD8+調節T細胞的產生中起重要作用[18]。Ly86基因編碼的蛋白是淋巴細胞抗原86，其在先天免疫系統和炎癥反應的生理或病理調節中有重要作用[19]。小鼠溶菌酶2基因(Lyz2)在未成熟的巨噬細胞中中等表達，在成熟的巨噬細胞中高表達，參與宿主的免疫反應[20]。小鼠免疫球蛋白G Fc結構域受體基因(Fcer1g)則已被確認為大腦皮質免疫模塊的關鍵基因，在β淀粉樣蛋白病理沉積轉基因小鼠的腦皮質中發揮重要作用[21]。Fcgr3基因系靈長類FCGR2A基因的直系同源基因[22]，編碼自然殺傷細胞上的免疫球蛋白G Fc段受體(FcγR III)[23]。FcR-γ基因敲除小鼠缺乏抗體介導的免疫反應，無法阻止體內腫瘤的生長，這表明Fc受體依賴性機制促進了細胞毒性抗體針對腫瘤的免疫作用[24]。跨膜4結構域亞家族A的成員6D基因(Ms4a6d)表達產物與巨噬細胞表面的免疫球蛋白超家族補體受體Vsig4相互作用形成表面抑制信號復合物(SISC)，造成小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)[25]。

本研究所得的10個關鍵基因主要是參加炎癥或者免疫反應相關的基因。既往研究證明，炎癥反應失調是DMD病理損害的重要機制[26]。DMD患者肌肉病理變化包括免疫學和炎性過程的異常、細胞自噬的缺陷和肌肉再生能力的喪失[27]。我們認為本研究的關鍵基因在DMD發病機制中亦是起調節炎癥反應與免疫反應的作用。大部分關鍵基因在mdx鼠中呈上調表達，只有Emr1基因呈下調表達，可能原因為：一方面，各基因對炎癥反應促進或抑制作用的共同效應導致了DMD的病理學改變趨向炎癥反應增強；另一方面，DMD致病機制涉及的免疫反應途徑具有一定特異性。

目前，針對DMD免疫機制的治療如皮質激素、免疫抑制劑、免疫靶向藥物等均能在一定程度上改善癥狀、延緩疾病進程[28]。本研究的所提出的差異表達基因和關鍵基因或能成為DMD免疫調節的特異性靶點，促進DMD免疫治療的發展。這些關鍵基因在杜興型肌營養不良癥發病機制中的作用以及作為生物標志物的有效性，還需要進一步實驗驗證。

4 結 論

本研究通過對3個mdx鼠數據集進行全面的生物信息學分析，提示炎癥反應和免疫反應相關分子機制在DMD的發病過程中起重要作用。篩選出的Tyrobq、Emr1、C1qb、Ly86、C1qc、C1qa、Lyz2、Ms4a6d、Fcer1g和Fcgr3等10個關鍵基因提示了DMD新的治療靶點。