顱內出血和窒息及肺炎新生兒血漿TSP-1含量檢測與分析

寧芬茹，肖 謐，林曉潔，王芳會，吳 芳，周熙惠

(西安交通大學第一附屬醫院新生兒科，陜西 西安 710061)

新生兒常見疾病如顱內出血、窒息、肺炎等發生率高，發病急，進展快，其中顱內出血、肺炎的早期臨床表現不典型，圍生期窒息則可引起多臟器功能損傷，如不能及時診斷和干預，將對患兒生長發育造成嚴重的影響，甚至危及生命。因此，應用簡單、高效、安全的診斷方法在新生兒疾病的臨床實踐中具有較高的應用價值。目前已有研究證實血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)與多種疾病的發生發展密切相關，但與新生兒疾病的相關性尚未見報道。因此，本研究通過檢測新生兒顱內出血、窒息及肺炎患兒血漿中的TSP-1含量，觀察其在上述疾病中的表達情況，分析TSP-1在新生兒疾病中的意義，為深入研究TSP-1在上述疾病進展過程中的病理生理機制奠定基礎。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2019年1月至2020年3月期間西安交通大學第一附屬醫院新生兒科收治的109例患兒，依據臨床病史、體征和頭顱超聲確診為新生兒顱內出血34例為顱內出血組；依據2013年中國醫師協會制定的新生兒窒息診斷標準確診為新生兒窒息26例為窒息組；依據葉鴻瑁等主編的《實用新生兒學(第5版)》確診為新生兒肺炎32例為肺炎組；選取同期入院的晚期早產兒或足月新生兒，均未合并顱內出血、窒息、肺炎及其他嚴重合并癥的17例患兒為對照組。

排除標準：①合并原發性心、肝、腎等器質性疾病及自身免疫性疾病；②先天染色體疾病或遺傳代謝疾病；③臨床資料缺失。所有研究對象的監護人均知情同意，此研究已通過本醫院倫理委員會審核批準。

1.2研究方法

各病例組及對照組患兒于入院后72h內采集空腹外周靜脈血1mL，置于抗凝采血管中，4℃冰箱靜置1h后，采用湖南湘儀L500離心機以3 000r/min的速度離心5min，獲得上清液，即為目標血漿，置于-80℃冰箱中保存待測。應用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血漿TSP-1水平，其中酶標儀為美國BIOTEK公司生產的Synergy H1，ELISA試劑盒購自美國CLOUD-CLONE CORP，嚴格按照說明書步驟進行具體操作。同期外周靜脈血采用深圳邁瑞CAL 8000血液分析儀檢測血小板計數。

1.3統計學方法

2結果

2.1各組的基本情況

在109例研究對象中，各病例組平均胎齡、體重、日齡分別與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組基本情況的比較結果Table 1 Comparison of the basic information of each

2.2各組血漿TSP-1含量的比較

對照組血漿TSP-1含量為(39.39±11.27)ng/mL；顱內出血組TSP-1含量為(24.09±13.53)ng/mL，顯著低于對照組(t=3.937，P<0.001)；窒息組TSP-1含量為(54.30±19.36)ng/mL，顯著高于對照組(t=2.826，P<0.01)；肺炎組TSP-1含量為(87.18±18.09)ng/mL，顯著高于對照組(t=9.711，P<0.001)，見圖1。

注：**表示P<0.01，***表示P<0.001。圖1 各組血漿TSP-1含量的比較結果Fig.1 Comparison results of plasma TSP-1 content in each group

2.3各組血小板計數的比較

顱內出血組、窒息組、肺炎組、對照組的血小板計數分別為(286.59±114.34)×109/L、(240.84±115.89)×109/L、(254.28±113.51)×109/L、(249.13±72.14)×109/L。各病例組患兒分別與對照組比較，差異均無統計學意義(t值分別為1.426、0.049、0.384，P>0.05)，見圖2。

注：ns(no significance)表示差異無統計學意義。圖2 各組血小板計數的比較結果Fig.2 Comparison of platelet counts in each group

2.4各組血漿TSP-1與血小板計數的相關性

對照組、顱內出血組、窒息組、肺炎組的血漿TSP-1水平與血小板計數均無相關性(r分別為0.166、0.298、0.215、0.194，P>0.05)。

3討論

現階段，對新生兒顱內出血、窒息和肺炎，通常需結合母親圍產期高危因素及患兒臨床表征、影像學、超聲檢查、實驗室檢查等進行綜合分析診斷，其中頭顱超聲雖有可床旁診斷及無創等優勢，但目前尚未在基層醫院推廣應用，且超聲診斷蛛網膜下腔、硬膜外等部位出血時的準確率較低；而X線及CT檢查具有潛在輻射危害，磁共振成像(MRI)檢測要求環境高，需搬動患兒，且對其鎮靜要求高。在輕度病變或者疾病的早期階段，通過血液標志物檢測能夠及時發現危險信號，可彌補現有檢查技術的局限性[1]。TSP-1于1971年首次從活化的血小板中分離出來[2]，后續研究證實人類TSP-1可由多種細胞合成及分泌，包括內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等[3-4]。TSP-1包含多個結構域，參與了多種生物學過程，其中包括胚胎發育、血管生成、組織修復和免疫調節等[4]。

3.1新生兒顱內出血與TSP-1的相關性

新生兒顱內出血是臨床新生兒時期常見的一種因早產、缺血缺氧或產傷引起的嚴重腦損傷，由于其死亡率較高、預后差，所以針對新生兒顱內出血的早期診斷研究備受關注。有研究證實，顱內出血誘導血小板、血管內皮細胞和炎性細胞等激化，進而導致基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9等血液標志物含量發生改變[5-6]。成人顱內出血患者血清TSP-1含量異常增高，可能通過調控基質金屬蛋白酶的表達水平破壞血管通透性而引發顱內出血[7-8]。本研究顯示，顱內出血患兒血漿TSP-1含量較低，與上述關于成人顱內出血患者的研究結果相反。分析其原因是由于新生兒顱腦尚未發育成熟，出血原因可能與成人有差異。新生兒顱內出血的發生率與胎齡密切相關，并且隨著胎齡增加而逐漸降低，說明腦血管的發育成熟度可能是其主要內在原因。同時，有研究表明，TSP-1在血管畸形的大腦內皮細胞中含量較低，是血管畸形的誘發因素之一[9]。另外，嚴重顱內出血患者的血小板缺乏完整的TSP-1，血小板聚集活性受損，加重了顱內出血程度[10-12]。上述均表明TSP-1表達缺失或降低，可能增加新生兒顱內出血的風險，與本研究結果一致，提示在臨床實踐中應予以關注。

3.2新生兒窒息與TSP-1的相關性

新生兒窒息是指嬰兒出生后沒有自主呼吸或者自主呼吸微弱[13]，從而導致低氧血癥、高碳酸血癥和/或代謝性酸中毒，可由產前、產時或產后的各種因素所致，是新生兒死亡的常見疾病之一，同時可導致患兒智力低下、腦癱、癲癇等永久性神經系統后遺癥。目前，TSP-1與窒息的相關性鮮有報道。本研究顯示，窒息患兒的血漿TSP-1含量較對照組顯著升高，可能由于窒息導致全身尤其是腦組織缺血缺氧，細胞應激釋放TSP-1。另有研究表明，胎盤組織高水平表達TSP-1導致血管內皮組織受損，造成胎盤組織出現反復缺氧、缺血[14-15]。Popescu等[12]研究發現，TSP-1作為一種趨化因子，能夠促進內皮細胞與中性粒細胞結合，具有抑制新生血管生成的作用。由此推測，窒息患兒高水平的血漿TSP-1含量與窒息腦損傷有關，且TSP-1可能通過抑制血管再生進一步加重患兒腦損傷。

3.3新生兒肺炎與TSP-1的相關性

新生兒肺炎對患兒呼吸功能損害明顯，因此，在肺炎病程中進行早期診斷具有重要意義[16]。既往研究證實，TSP-1在機體免疫、炎癥和代謝中扮演重要角色；同時，TSP-1有助于T細胞的黏附和滲出，促進中性粒細胞的炎性趨化[17-18]；TSP-1亦可通過影響抗原提呈細胞參與免疫反應調節[19]。有研究指出TSP-1介導肺炎球菌和葡萄球菌與人肺上皮細胞的黏附[20]。上述均提示TSP-1含量有可能作為新生兒肺炎的一種血液檢測標志物，輔助臨床早期診斷。本研究顯示，血漿TSP-1水平顯著高于對照組；其原因可能是由于新生兒免疫系統發育尚未成熟，細菌感染導致上皮細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等在受到炎癥刺激后高表達TSP-1[21]，進一步增加了細菌與細胞的黏附，加重了肺炎病情，這也可能是新生兒肺炎發病急、進展快的內在原因之一。

3.4 TSP-1與血小板的相關性

由于血小板是TSP-1最主要的來源，因此其數量可能對TSP-1水平有較大的影響。本研究中血小板計數結果可見，各病例組血小板數量與對照組均無顯著差異；相關性分析表明，各病例組的血漿TSP-1水平與血小板均無相關性，推測新生兒血漿TSP-1除了由血小板α顆粒分泌外，還可能由單核/巨噬細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等多種細胞應激而釋放[3-4]。

本研究不足之處在于樣本量較少，部分數據可能出現偏倚，后期應考慮在更大樣本量的病例中進行驗證；其次，本研究納入的病例多在收治3天內登記采血，未來應考慮在收治當天采血，并進一步研究TSP-1在新生兒多種疾病病程中的動態變化及相關病理生理機制，這將有助于患兒疾病的輔助診斷，從而盡早制定最佳治療方案。