提取方法對香蕉皮粗多糖的組成、性質及結構的影響

劉小辰，林海龍*

（國投生物科技投資有限公司，北京 100034）

香蕉（Musa nana）屬于芭蕉科芭蕉屬植物，廣泛種植于熱帶地區[1]。作為世界上栽培香蕉的古老國家之一，我國也有大面積栽培[2]。香蕉因其營養豐富、風味獨特、口感甚佳深受人們的喜愛。香蕉皮占香蕉總質量的30%～40%[3]，在加工后一般會被直接丟棄，不僅會造成資源浪費，還會對環境造成污染。國內外有很多對香蕉的研究，但多數集中在香蕉果肉上，對香蕉皮的研究和利用較少。

多糖（polysaccharides）是近年來研究的熱點，其具有多種生理功能如抗氧化[4]、降血糖血脂[5]、降膽固醇、抗腫瘤[6]、免疫調節、調節腸道菌群[7]、保濕[8]等。香蕉皮中含有大量多糖，具有很大的應用潛力。王麗娟等[9]采用熱水提取法從香蕉皮中提取多糖，香蕉皮粗多糖（banana peel crude polysaccharide，BPCP）得率為4.25%。朱開梅等[10]則進一步在熱水浸提的基礎上加入超聲輔助，并對提取條件進行優化，最終香蕉皮多糖得率可達13.85%，且該多糖對人乳癌細胞MCF-7具有顯著的抑制作用。趙廣河等[11]通過單因素及正交試驗優化了酸提與酶提香蕉皮多糖的工藝，并對提取效果進行了對比，發現酶法提取的得率明顯高于酸法提取[12]。

為了比較不同提取方法對香蕉皮粗多糖（BPCP）結構的影響，本實驗采用熱水浸提（hot water extraction，HWE）、酸輔助提取（acid assisted extraction，ACAE）、堿輔助提取（alkali assisted extraction，ALAE）、酶法浸提（enzyme extraction，EE）、高壓熱水提取（high pressure hot water extraction，HPHWE）、超聲熱水提取（ultrasonic hot water extraction，UHWE）等6種方法進行香蕉皮粗多糖（BPCP）的提取，比較不同提取方法下BPCP化學組成、分子質量、單糖組成、表觀結構、表觀黏度等性質的差異，以期為香蕉副產物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉皮：市售香蕉的皮；果膠酶（酶活5 U/mg）、纖維素酶（酶活10 U/mg）、牛血清蛋白（純度≥98%），葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；拜耳醫藥保健有限公司；體積分數80%乙醇、苯酚、濃硫酸、鹽酸、考馬斯亮藍（均為分析純）：國藥集團化學試劑（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ5200DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市子華儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Waters-2998紫外檢測器：美國Waters公司；DAWN HELEOS-II激光光散射儀：美國Wyatt公司；Bruker VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜：德國Bruker公司；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本Hitach公司；HAAKE MARS流變儀：美國熱電公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機：德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 香蕉皮粗多糖提取方法及制備

熱水浸提法（HWE）[9]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

酸輔助提取（ACAE）[13]：取香蕉皮100 g加入1 L檸檬酸（pH值為2）打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

堿輔助提取（ALAE）[13]：取香蕉皮100 g加入1 L NaOH（0.5 mol/L）打漿，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

酶法浸提（EE）[14]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，調pH至6.0（0.1 mol/L NaOH），加入0.5%果膠酶和1.0%纖維素酶，于50 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

高壓熱水提取（HPHWE）[15]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，在115 ℃、0.2 MPa條件下提取2 h。

超聲熱水提取（UHWE）[16]：取香蕉皮100 g加入1 L去離子水打漿，在超聲功率400 W、50 ℃條件下處理30 min，于90 ℃水浴攪拌（350 r/min）提取2 h。

香蕉皮粗多糖提取結束后，冷卻至室溫，8 000 r/min離心15 min，200目紗布過濾得上清液，加入體積分數80%的乙醇，4 ℃條件下醇沉24 h，10 000 r/min離心20 min收集沉淀，超純水沉淀復溶，減壓旋蒸除去乙醇。再經過5 kDa超濾膜進行超濾，收集大分子，減壓旋蒸（溫度60 ℃，真空度0.1 MPa），-40 ℃凍干24 h得到香蕉皮粗多糖。

1.3.2 分析與檢測

總多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[17]。將粗多糖配制為0.1 mg/mL的溶液，移取1 mL樣品溶液于玻璃試管中，加入1 mL 現配的6%苯酚溶液與5 mL濃硫酸，充分振蕩混勻后靜置反應25 min，于波長490 nm處測定吸光度值。用蒸餾水代替樣品溶液，作為空白對照測定其吸光度值。以葡萄糖為標準品繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中總多糖的含量。

總蛋白含量的測定：采用Bradford法[18]。將粗多糖配制為0.1 mg/mL的溶液，移液槍移取50 μL樣品溶液，滴加到96孔板中，再加入200 μL的考馬斯亮藍試劑。靜置10 min后，用酶標儀在波長595 nm處測得溶液的吸光度值。用磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，作為空白對照測定其吸光度值。以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質的含量。

分子質量分布測定[19]：采用凝膠色譜法（gel permeation chromatography，GPC）測定多糖分子質量。將香蕉皮粗多糖配制為質量濃度10 mg/mL的溶液，進樣量為20 μL，Ultrahydrogel保護柱（40 mm×6 mm），Ultrahydrogel 2000 SEC色譜柱（7.8 mm×300 mm）和Ultrahydrogel 1000 SEC（7.8 mm×300 mm）串聯使用，柱溫30 ℃，以超純水為流動相，流速0.5 mL/min，采用示差檢測器（refractive index detector，RID）檢測多糖峰。用葡聚糖標品制作標準曲線，確定樣品分子質量。

單糖組成分析：采用高效液相色譜法[20]，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱，柱溫30 ℃，流動相為0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）和乙腈的混合溶液（83∶17，V/V）。控制流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為245 nm。

傅里葉變換紅外光譜分析[21]：1 mg樣品與100 mg KBr混合并充分研磨至均勻粉末，壓片。于波數3 750～500 cm-1范圍掃描，分辨率為4 cm-1。

掃描電子顯微鏡觀察[22]：樣品放于雙面膠帶上并噴薄金層，以15.0 kV的加速電壓于掃描電子顯微鏡觀察臺上收集圖像，放大倍數為1 000。

流變學特性測定[22]：分別配制質量濃度為10 g/100 mL的樣品溶液，于20 ℃、剪切速率1～100 s-1條件下使用流變儀測定不同BPCP的表觀黏度。

1.3.3 數據處理

所有實驗均重復3次，結果取平均值，表示為“平均值±標準差”（n=3）。使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的化學組成

不同提取方法得到的香蕉皮粗多糖的化學組成見表1。由表1可知，提取方式對粗多糖的總多糖、總蛋白含量有顯著影響。與其他提取方式相比，BPCP-ACAE的總多糖含量較低（7.54%），這可能是由于酸提取的樣本中含有大量酚類、色素等。通過其他方式獲得的粗多糖中總多糖含量都在30%以上，其中BPCP-UHWE總多糖最高（39.62%）。BPCP-ACAE和BPCP-HPHWE中不含蛋白質，BPCP-ALAE中總蛋白含量最高（17.77%）。因此，香蕉皮粗多糖更適合采用超聲熱水提取的方法制備。

表1 不同提取方法對香蕉皮粗多糖化學組成的影響Table 1 Effect of different extraction methods on the chemical composition of banana peel crude polysaccharides

2.2 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的分子質量分布情況

不同提取方式得到的香蕉皮粗多糖的平均分子質量分布情況見表2。由表2可知，不同提取方式制備的香蕉皮粗多糖分子質量分布有顯著差異。BPCP-HPHWE多為分子質量較小的多糖，其分子質量為2.68 kDa的多糖占94.4%，說明BPCP-HPHWE分子質量分布較為集中。

表2 不同提取方法對香蕉皮粗多糖分子質量分布的影響Table 2 Effect of different extraction methods on the molecular mass distribution of banana peel crude polysaccharides

2.3 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的單糖組成

由表3可知，幾種BPCP的單糖組成差異顯著，均含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。BPCP-ACAE中不含有鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖；BPCP-ALAE不含有半乳糖；BPCP-HPHWE不含有葡萄糖、阿拉伯糖；BPCP-HWE不含有氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖；BPCP-UHWE、BPCP-EE均不含有氨基葡萄糖、木糖。不同的制備手段對細胞壁的破壞程度不同，進而導致溶出物的組成和化學結構不同，這可能是本研究獲得的六種多糖在單糖組成上明顯差異的關鍵因素[23-24]。

表3 不同提取方法對香蕉皮粗多糖的單糖組成的影響Table 3 Effect of different extraction methods on monosaccharide composition of banana peel crude polysaccharide

2.4 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖傅里葉變換紅外光譜結果

由圖1可知，粗多糖在3 750～500 cm-1波數范圍內具有明顯的多糖特征吸收峰。波數3 340 cm-1處的吸收峰為O-H的伸縮振動峰，波數2 931 cm-1附近的吸收峰與糖環中C-H的伸縮振動有關[25]。波數1 750 cm-1處的吸收峰是由C=O的伸縮振動引起的[25]，波數1 600 cm-1和1 410 cm-1處的吸收峰是由羧基（COO-）的非對稱和對稱伸縮振動引起的[27]，波數1 200～1 000 cm-1范圍的兩個吸收峰證明了吡喃糖苷的存在[28]。不同提取方式得到的香蕉皮粗多糖有機官能團組成無明顯差異。

圖1 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of banana peel crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.5 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖分子形態觀察結果

不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的掃描電鏡圖結果圖2。由圖2可知，BPCP-HWE與BPCP-UHWE有著相似的結構，表面光滑，分子間結合緊密；BPCP-HPHWE表面光滑，整體結構呈乳液狀；BPCP-ALAE、BPCP-EE、BPCP-ACAE均為分散型結構，其中BPCP-ALAE、BPCP-ACAE呈顆粒狀聚集，BPCP-EE呈碎片狀、表面疏松多孔。可能是不同處理方式獲取的多糖種類不同，以及對糖苷鍵及多糖鏈內與鏈間的氫鍵破壞程度不同，進而造成多糖表面微觀結構的明顯差異[29]。

圖2 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of banana peel crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6 不同提取方法得到香蕉皮粗多糖流變學特性結果

不同提取方法得到香蕉皮粗多糖流變特性見圖3。由圖3可知，在實驗涉及的剪切速率范圍內，BPCP-HWE（0.006～0.023 mPa·s）和BPCP-UHWE（0.006～0.016 mPa·s）的黏度始終高于其他幾種多糖，具有更大分子質量的BPCP-ACAE表觀黏度則比較小（0.001～0.005 mPa·s），說明分子質量不是影響BPCP黏度的主要因素。但是結合SEM表觀結構觀察結果可以看出，BPCP-UHWE與BPCP-HWE有相似的結構，均為比較大的塊狀固體，說明其分子間結合比較緊密，這可能是造成其高黏度的原因。隨著剪切速率的增加，BPCP的黏度也隨之下降，呈現明顯的剪切稀化現象[30]，這是因為在高剪切速率下多糖溶液中的分子交聯會因為外力的作用斷裂，造成溶液黏度的下降[19]。

圖3 不同提取方法對香蕉皮粗多糖流變特性的影響Fig.3 Effects of different extraction methods on the rheological properties of banana peel crude polysaccharides

3 結論

本實驗對比了6種不同提取方法對BPCP的化學組成、分子質量、單糖組成、表觀結構、表觀黏度等的影響。結果表明，BPCP-UHWE總多糖含量最高（39.62%），BPCP-ALAE中總蛋白含量最高（17.77%）；不同BPCP的平均分子質量分布及單糖組成存在明顯差異；BPCP-W與BPCP-UHWE均為分子間結合比較緊密大塊狀結構，表面光滑；BPCP-HPHWE表面很光滑，呈乳液狀；BPCP-ALAE、BPCP-ACAE呈顆粒狀聚集，BPCP-EE呈碎片狀、表面疏松多孔。BPCP的表觀黏度與其平均分子質量大小無關，而與其表觀結構明顯相關。綜上所述，不同提取方法對BPCP的化學組成、分子質量、單糖組成、表觀結構、表觀黏度等均有較大的影響。