復治肺結核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞與細胞因子、自由基生成的關系分析

趙新惠，王德翠，田新村，魏海冬，劉觀斌（濱州市中心醫院檢驗科 山東 濱州 251700）

肺結核是威脅人類健康的公共性衛生疾病，該病由結核分枝桿菌感染引起，病原菌的數目和毒理是決定病情轉歸的關鍵因素。結核分枝桿菌侵入呼吸道后，機體能夠通過自身的免疫應答機制來清除病原菌；而當機體免疫應答發生紊亂時，侵入呼吸道的結核分枝桿菌無法并清除并不斷繁殖，進而造成肺結核的發生和發展。近年來，機體細胞免疫應答紊亂與結核分枝桿菌感染的關系受到了越來越多的關注，多種介導細胞免疫應答的免疫細胞含量及相應細胞因子的分泌均發生改變。調節性T細胞是在細胞免疫應答中發揮負性調控的T細胞亞群，細胞表面的標志分子為CD4、CD25及Foxp3，能夠通過細胞接觸抑制以及分泌抑制性細胞因子的方式來發揮負性免疫調控作用[1]。復治肺結核患者是耐藥結核病的高發人群、臨床治療棘手[2]，為了明確Treg細胞在復治肺結核發生過程中所起到的作用，本研究具體分析了復治肺結核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+Treg與細胞因子、自由基生成的相關性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月—2020年6月在我院就診的復治肺結核患者和初治肺結核患者分為復治組34例和初治組42例，均參照中華醫學會結核病學分會制定的肺結核診斷和治療指南進行診斷[3]，排除合并惡性腫瘤、矽肺、塵肺、自身免疫性疾病的患者。復治組共34例，男性18例、女性16例，年齡31～47歲，平均（39.41±5.58）歲，合并糖尿病9例、高血壓5例；初治組共42例，男性24例、女性18例，年齡32～45歲，平均（38.93±4.92）歲，合并糖尿病13例、高血壓5例。另取同期體檢的50名健康者作為對照組，男性28名、女性22名，年齡33～50歲、平均（39.41±4.59）歲。三組一般資料比較無統計學差異（P＞0.05），有可比性。

1.2 外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的測定

取三組的空腹肘靜脈血2 m L，肝素抗凝后加入紅細胞裂解液，孵育15 m i n后離心得到細胞沉淀，調節細胞密度至1×104/L后避光孵育C D4+、C D25+、Foxp3+的熒光抗體20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌離心2次后，在流式細胞儀上測定CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的含量。

1.3 血清指標的檢測方法

取三組的空腹肘靜脈血8 mL，離心分離血清后采用酶聯免疫吸附法測定高遷移率族蛋白1（HMGB1）、巨噬細胞刺激蛋白（MSP）、單核細胞趨化蛋白（MCP1）、干擾素誘導蛋白10（IP-10）、巨噬細胞炎癥蛋白1α（MIP-1α）的含量，采用分光光度法測定對氧磷酶1（PON1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX），采用二甲酚橙法測定總氧化態（TOS）、總抗氧化態（TAS）的含量。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 18.0統計軟件進行處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析；計數資料用頻數表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的比較

初治組、復治組、對照組外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞含量分別為（1.78±0.25）%、（2.83±0.37）%、（1.03±0.17）%。經方差分析，三組間CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的比較有統計學差異（F=474.73,P＜0.05），且復治組外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的含量高于初治組及對照組（P＜0.05）。

2.2 血清中炎癥細胞因子的比較

三組間血清HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與初治組及對照組比較，復治組血清中HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組間血清炎癥細胞因子的比較（±s）

表1 三組間血清炎癥細胞因子的比較（±s）

MSP/（pg·mL-1）復治組34 5.68±0.78 265.12±33.29 302.39±32.95初治組42 3.89±0.52 229.34±32.39 252.31±29.93對照組50 3.12±0.38 132.48±15.95 213.48±29.58 F 216.50 272.75 85.357 P 0.000 0.000 0.000組別 例數 HMGB1/（ng·mL-1）MCP1/（pg·mL-1）MIF-1α/（pmol·L-1）復治組34 4.85±0.64 39.12±4.58初治組42 3.31±0.45 28.41±3.77對照組50 2.45±0.32 23.12±3.39 F 267.93 174.67 P 0.000 0.000組別 例數 IL-10/（μmol·L-1）

2.3 血清中自由基生成指標的比較

三組間血清GPX、TOS、TAS的比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與初治組及對照組比較，復治組血清中TOS的含量明顯升高，GPX、TAS的含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組間血清自由基生成指標的比較（±s）

表2 三組間血清自由基生成指標的比較（±s）

TAS/（μmol·L-1）復治組34 75.92±9.49 23.41±3.29 1.47±0.22初治組42 95.31±11.35 14.85±1.85 1.94±0.29對照組50 125.42±14.83 7.39±0.94 2.53±0.33 F 169.44 593.67 139.01 P 0.000 0.000 0.000組別 例數 GPX/（U·mL-1）TOS/（μmol·L-1）

3.討論

復治肺結核的發生與結核桿菌的數目、毒理以及機體的抗感染能力均有密切關系[4]。機體抗結核感染的能力與體內細胞免疫應答直接相關，C D4+、C D25+、F o x p3+T細胞、即T r e g細胞是參與細胞免疫應答負性調控的細胞亞群，能夠抑制免疫應答并增加多種病原菌感染的風險。本文對復治肺結核患者外周血中Treg細胞的分析發現：復治組外周血中CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞的含量顯著低于初治組及對照組（P＜0.05）。結果表明Treg細胞的增多與復治肺結核的發生有關，結合Treg的生物學功能推測，增多的Treg能夠抑制細胞免疫應答對結核分枝桿菌的清除作用、進而造成復治肺結核的發生。

在復治肺結核患者體內，持續的結核分枝桿菌感染具有極強的致炎活性，能夠引起體內炎癥反應發生級聯激活并增加多種炎癥細胞因子的釋放。HMGB1屬于晚期炎癥介質，能夠通過其促炎活性來保證炎癥反應處于持續激活的狀態[5]；MCP1和MSP分別促進單核細胞和巨噬細胞定向移動[6-7]；IP-10、MIP-1α分別促進淋巴細胞、中性粒細胞的趨化運動[8]。對復治肺結核患者血清中上述炎癥細胞因子的分析發現：復治組血清中HMGB1、MCP1、MSP、IP-10、MIP-1α的含量顯著高于初治組及對照組且與Treg呈正相關。結果表明復治肺結核患者體內Treg的增多能夠在加重結核分枝桿菌感染的基礎上促進體內炎癥反應激活、增加炎癥細胞因子的分泌。

炎癥反應的激活過程還能產生自由基并通過氧化應激反應來造成局部組織發生損傷[9]。大量生成的自由基能夠使體內TOS明顯增多，同時也會使抗氧化酶GPX大量消耗；TOS和TAS的變化最終造成氧化還原的平衡被打破[10]。這一結果表明復治肺結核患者體內Treg的增多能夠在加重結核分枝桿菌感染的基礎上促進氧自由基的生成、加重氧化應激反應。

綜上所述，復治肺結核患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞明顯增多；增多的CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞能夠造成免疫細胞因子紊亂、炎癥細胞因子及自由基生成增多。