PTCH1基因多態(tài)性與食管鱗癌放療敏感性的相關(guān)性分析

陳森明，陳偉忠，章耀鴻

（1潮州市人民醫(yī)院腫瘤科 廣東 潮州 521000）

（2潮州市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 廣東 潮州 521000）

在世界范圍內(nèi)，食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，食管癌發(fā)病有顯著性地域特點(diǎn)。我國食管癌90%以上為鱗癌，發(fā)病率在全部惡性腫瘤排名第6位（6.78%），死亡排名第4位（8.04%），主要原因還是食管癌早期診斷難，中晚期治療效果差。放射治療是中晚期食管癌治療最主要手段之一[1]，蔣曉東等[2]研究提示人類同源的果蠅片段基因1（Protein patched homolog 1, PTCH1）在22例食管癌患者中均有突變，其中rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)僅見于放射抗拒組。本文利用特異性引物（Polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增測序檢測食管鱗癌（esophageal cancer, ESCC）患者的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP），分析不同基因型患者放射治療的近期療效，探討的基因多態(tài)性與食管鱗癌患者放療敏感性的關(guān)系。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年12月—2020年6月在潮州市人民醫(yī)院腫瘤科行放射治療的初治食管鱗癌患者105例，其中98例能成功擴(kuò)增并測序PTCH1基因位點(diǎn)，本文對該98例患者進(jìn)行分析。所有患者均經(jīng)病理活檢確診為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中男性71例，女性27例，平均年齡62.6歲，中位年齡60歲。頸段胸上段8例，胸中段63例，胸下段27例。按《非手術(shù)治療食管癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)（草案）》（2010年），Ⅱ期24例，Ⅲ期74例。所有病例治療前一般狀態(tài)好，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無重要器官功能障礙，卡氏評分均≥70分。本次得到汕頭大學(xué)附屬潮州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)許可，所以患者或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

所有患者均行三維適形放療（3-Dimensional Conformal Radiatherapy, 3DCRT）或調(diào)強(qiáng)放療（Ⅰntensity-Modulated Radiation Therapy, ⅠMRT），其中三維適形放療40例，調(diào)強(qiáng)放療58例。靶區(qū)勾畫和計(jì)劃評價(jià)參照第4版腫瘤放射治療學(xué)[3]，患者仰臥，雙臂置體側(cè)，頭過伸，體部熱塑膜固定。在CT模擬機(jī)上行胸部增強(qiáng)掃描，三維適形放療層厚5 mm，調(diào)強(qiáng)放療層厚3 mm，掃描圖像傳輸至放射性粒子治療計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行重建和靶區(qū)勾畫，放療劑量：GTV60～64 Gy（Gray），PTV50～54 Gy。全部病例均給予奈達(dá)鉑（20 mg/m2/周）行同步化療。

1.3 療效評價(jià)

全組病例治療結(jié)束時(shí)及結(jié)束1月后均行食管鋇餐造影和胸部增強(qiáng)CT。按RECIST標(biāo)準(zhǔn)將療效分CR（Complete Remission）組、PR（Partial Remission）組、SD（Stable Disease）組、PD（Progressive Disease）組。CR和PR為放療敏感組，SD和PD為放療抗拒組。

放療近期療效根據(jù)萬鈞等（1989）提出的《腫瘤放射治療療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[4]，由2位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的放療科醫(yī)師于放療后1～3個(gè)月分別獨(dú)立評價(jià)患者的近期療效。

1.4 引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系

針對PTCH1基因SNP: rs199476092和rs202111971，根 據(jù)NCBI的PCTH1基 因 系 列（NC_000009.12），采用LightScanner引物設(shè)計(jì)軟件（Ⅰdaho TechnologyⅠdaho Technology，美國）設(shè)計(jì)高分辨熔解曲線（High Resolution Melting, HRM）的引物（圖1）。所有引物由蘇州金唯智公司合成。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR反應(yīng)預(yù)混液5.0μL,上下游引物各0.5μL, LC Green 1.0μL，基因組DNA 2.0μL，并用蒸餾水將反應(yīng)體積補(bǔ)足到10.0μL。PCR的擴(kuò)增反應(yīng)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)。

圖1 2個(gè)SNP位點(diǎn)的序列、探針以及引物

1.5 SNP的基因分型

完成PCR擴(kuò)增后，按照LightScanner 96分析儀操作步驟，對產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，在70～95 ℃收集熒光信號數(shù)據(jù)。采集熒光信號并繪制熔解曲線，進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。熔解溫度相同的歸為同一基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析。不同基因型組之間放療敏感性差異以例數(shù)表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果

截至2020年9月30日，隨訪2～49.2個(gè)月，有6例隨訪不到，中位隨訪26.5個(gè)月，隨訪率為93.9%。截止隨訪時(shí)間，98例患者中死亡75例，其中局部復(fù)發(fā)35例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例，復(fù)發(fā)+轉(zhuǎn)移30例。

2.2 放療療效

98例患者中放療敏感組82例，放療近期總有效率為83.7%；其中Ⅱ期患者共24例，放療敏感組23例，放療近期有效率為95.8%；Ⅱ期患者共74例，放療敏感組59例，放療近期有效率為79.7%。全組基本資料與放療療效的關(guān)系見表1。余未見顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 98例食管鱗癌放療近期療效比較

2.3 基因表達(dá)

98例患者血液中均可見PTCHl表達(dá)，PTCHl基因的表達(dá)與患者性別、食管癌分期、年齡、吸煙情況、酗酒均無關(guān)，與腫瘤的分化程度（高中分化、低分化）有關(guān)，高中分化的食管癌組織中PTCHl表達(dá)量4.86（4.24±1.42）低于低分化腫瘤中PTCHl基因的表達(dá)量5.59（4.64±2.55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.討論

潮汕地域是全國有名的食道癌高發(fā)地，發(fā)病率高達(dá)40/10萬人，每年新發(fā)病例估量超越5 000例，是一種嚴(yán)重影響本地人民健康的惡性腫瘤。食管癌早期癥狀不明顯，早期診斷難，在醫(yī)院接受治療的食管癌患者大多數(shù)處于中晚期，治療效果不佳，5年生存率15%～24%，也有報(bào)道單純放療5年生存率不到10%的[4]。放療是治療局部晚期食管癌和其他原因不能手術(shù)的早期食管癌患者的主要手段，在強(qiáng)化局部腫瘤控制，防止局部復(fù)發(fā)中具有重要的作用。研究表明，將治療劑量從50 Gy（Gray）增加到70 Gy并不能相應(yīng)提高療效，說明劑量因素并非影響療效的關(guān)鍵[6]。臨床上，放療結(jié)束后分期相同的患者腫瘤消退程度差距很大，這種差異在很大程度上取決于基因序列上極小的遺傳差異，主要表現(xiàn)在單核苷酸多態(tài)性（SNP）[8]。人群因素是影響基因遺傳多態(tài)性受的一個(gè)重要的因素。相對于其他地區(qū)的人群，潮汕地區(qū)的人群具有自身獨(dú)特的基因多態(tài)性。

PCTH1是HH（Hedgehog）信號傳導(dǎo)途徑上的一個(gè)重要基因。有研究表明，HH在多種腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[7]。而功能性PTCH1等位基因的沉默是HH通路激活和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，正常情況下，PTCH1基因?qū)MO（Smoothened）具有抑制作用，因此，有學(xué)者認(rèn)為PTCH1是一種抑癌基因。陳振華等[5]的研究表明：PTCH1基因與食管癌的發(fā)生及惡性程度有關(guān)，但對于該基因與放療敏感性關(guān)系研究極少；蔣曉東等研究PTCH1基因在食管癌患者中均有非同義變異，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)的2個(gè)SNP位rs199476092和rs202111971位點(diǎn)能影響PTCH1基因功能，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，導(dǎo)致食管癌患者產(chǎn)生放射抗拒性，致其放療療效較差。但其研究僅有22例，樣本量比較小，而且放療采用單純放療，不是目前標(biāo)準(zhǔn)的同步放化療。

本研究針對潮汕人群的PTCH1基因多態(tài)性與食管癌放療效果的相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示105例食管鱗癌患者中有98例能成功擴(kuò)增并測序PTCH1基因位點(diǎn)。98例患者全組放療近期有效率為83.7%，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，PTCH1在98例患者中均有突變，其中rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)僅見于放射抗拒組。而且PTCHl基因的表達(dá)與患者性別、食管癌分期、年齡、吸煙情況、酗酒均無關(guān)，與腫瘤的分化程度（高中分化、低分化）有關(guān)，高中分化的食管癌組織中PTCHl表達(dá)量4.86（4.24±1.42）低于低分化腫瘤中PTCHl基因的表達(dá)量5.59（4.64±2.55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTCH1編碼區(qū)內(nèi)rs199476092和rs202111971突變位點(diǎn)與食管鱗癌患者的放射敏感性密切相關(guān)，可能是放療抗拒的預(yù)測指標(biāo)，這將對指導(dǎo)患者個(gè)體化治療具有重要意義。